基于HS-GC-IMS 技術分析桑葉發酵過程中揮發性物質的差異

李學震，孫慶澤，劉光鵬，馬艷蕊，呂緒強，崔艷平，和法濤*

（1.中華全國供銷合作總社濟南果品研究所，山東 濟南 250220；2.山東省果蔬貯藏加工技術創新中心，山東 濟南 250220；3.山東農業工程學院食品科學與工程學院，山東 淄博 250100）

桑葉（Folium Mori）是?？疲∕oraceae）桑屬（Morus L.）植物的葉片，富含生物堿、必需氨基酸、酚類化合物和多糖等生物活性成分[1]。其中，1-脫氧野尻霉素（1-Deoxynojirimycin）作為一種生物堿，在桑葉中含量為1‰左右，能有效抑制血糖生成，起到降血糖的作用[2-3]。但桑葉具有生青味與豆腥味，在飲料、茶等產品的應用過程中會產生不良風味，影響消費者感官體驗。

金花菌（Aspergillus chevalieri）是茯磚茶中的一類真菌，分為有性型（Eurotium）和無性型（Aspergillus）兩類，目前多數學者認為金花菌是冠突散囊菌（Eurotium cristatum）[4]。Rui 等[5]將茯磚茶中金花菌分離純化后得到A.chevalieri、A.cristatus、E.cristatum 等多種菌株，因此有學者有認為金花菌是一類菌群。研究表明，經過金花菌發酵后能增加黑毛茶的陳香和花香，并增加黃酮類、醇類、酯類和醛類等化合物含量，減少以生青氣味為特征的萜烯類物質含量和種類[6-7]。目前，關于桑葉發酵方面的研究主要集中在桑葉茶和動物飼料的加工中，直接利用金花菌發酵桑葉的研究較少，并且發酵過程中揮發性物質變化規律不明確。頂空氣象離子遷移譜（HS-GC-IMS）技術是一種快速鑒別樣品中揮發性物質差異性的可視化技術，常用于農產品、中藥材、食品、發酵產品等的揮發性物質鑒定，具有靈敏度高、檢測方便快捷、可視化程度高等優點[8]。鑒于此，本研究利用HS-GC-IMS 技術明確桑葉發酵過程中的揮發性物質差異，為桑葉提取物、果蔬發酵和動物飼料等方面的加工與應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

金花菌（A.chevalieri）分離自茯磚茶，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC），保藏號：CGMCC No.23051；桑葉（干燥），山東省臨清清源正本生物醫藥科技有限公司；PDB（馬鈴薯葡萄糖培養基），北京索萊寶生物科技有限公司；C4～C9混合正構酮標準品，色譜純，濟南海能儀器有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

氣相色譜離子遷移譜儀，SPL-250，德國G.A.S 公司；分析天平，ME-104，梅特勒托儀器有限公司；BSC-150 恒溫培養箱、YXQ-LS-100A 立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業有限公司醫療設備廠； 恒溫調速搖床柜，ZWYR-2112B，上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液制備

取保藏于-80 ℃冰箱的金花菌種子液，接入PDB 培養基中活化5～7 d，培養溫度30 ℃，搖床轉速150 r/min，待菌絲布滿搖瓶中，根據GB 4789.2—2022 測菌落總數，制備菌落數約為1.16×108CFU/mL 的種子液。

1.3.2 桑葉發酵

取15 g 桑葉于三角瓶中，115 ℃滅菌15 min，加入12 mL 種子液，發酵溫度30 ℃，分別發酵3、5、7、9、11 d，同時設置空白對照組[9]（每組設置3 個平行）。發酵好的桑葉放入60 ℃干燥箱內烘干，研磨后置于干燥器內保存備用，并分別標注A 組（未發酵）、B 組（發酵3 d）、C 組（發酵5 d）、D 組（發酵7 d）、E 組（發酵9 d）、F 組（發酵11 d）。

1.3.3 GC-IMS 檢測揮發性成分

根據Wang 等[10]的方法進行檢測并稍作修改。分別稱取1 g 桑葉粉末于20 mL 頂空進樣瓶中，每組設置3個平行，以500 r/min 的轉速，40 ℃孵育15 min 后開始進樣。

GC-IMS 條件：MXT-5 氣相色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm），IMS 溫度45 ℃，色譜柱溫度60 ℃，進樣針溫度85℃，載氣/ 漂移氣N2（純度99.999%），分析時間20min，進樣體積500 μL。

氣相色譜條件：0～2 min，漂移氣150 mL/min，載氣2mL/min；2～10min，漂移氣150mL/min，載氣2～10mL/min；10～20 min，漂移氣150 mL/min，載氣10～100 mL/min。

1.4 數據處理

GC-IMS 儀器中配備的Vocal 軟件進行數據查看、定性和譜圖分析，使用軟件內置的IMS 數據庫和Hanon 數據庫進行物質定性分析；Gallery 插件、Reporter 插件和Dynamic PCA 插件分別用于指紋圖譜的繪制、圖譜差異對比和主成分分析。

2 結果與分析

2.1 發酵桑葉揮發性物質定性分析

氣相離子遷移色譜（GC-IMS）是一種快速、無損和高通量的檢測技術，在食品、中草藥和天然產物等揮發性物質的檢測中起到重要作用[11]。通過HS-GC-IMS 分析，揭示了桑葉發酵過程中揮發性物質的差異，在測試的6個樣品中（A～F 組）共檢出68 種揮發性物質，與數據庫匹配定性出45 種，如表1 所示，主要有醇類10 種、醛類10 種、酯類9 種、酮類8 種、醚、烯和酸類各2 種、烷烴和噻唑各1 種。其中，1-辛烯-3-醇、庚醛、戊醛、異戊醛等物質在桑葉發酵茶的研究中有所報道[12]。

表1 桑葉發酵過程中主要揮發性物質Table 1 The main volatile substances in the fermentation of mulberry leaves

2.2 桑葉發酵過程中揮發性物質差異對比

圖1 是桑葉發酵過程中HC-GC-IMS 二維差異圖。以未發酵的桑葉為參比，對其他發酵時間的譜圖進行了扣減參比。深色表示揮發性物質高于參比，淺色表示揮發性物質低于參比，點的面積大小和顏色深淺表示該物質的相對含量多少[13]。圖1 中多數信號峰的保留時間為100～400 s（400～500 s 數據不是發酵桑葉中的主要物質，因此不做分析），遷移時間為1.0～2.0 ms 區域，桑葉經過發酵后揮發性物質種類豐富，部分物質減少甚至消失。

圖1 桑葉發酵過程中HS-GC-IMS 二維差異譜圖Fig.1 HS-GC-IMS two-dimensional difference spectrum during mulberry leaf fermentation

結合指紋圖譜（圖2）分析，發酵前后共有的揮發性物質有乙二醇二甲醚、乙二醇一丁醚、甲基庚稀酮、(E,E)-2,4-庚二烯醛、乙酸甲酯、反式-2-戊稀醛、丁酸乙酯、2-甲基丁醇、3-甲基丁醇、2-庚酮和甲基異丁基酮，這些揮發性物質都具有水果香氣或花草香氣（圖2c）；通過‘金花菌’發酵能使苯甲醛甘油縮醛（具有苦味）、硫丙醇（具有臭味）[14]、1-辛烯-3-醇（具有土腥味）[15]、1-戊稀-3-酮（具有辛辣刺激性氣味）和己醇（具有青草、嫩枝葉氣味）等具有不良氣味的物質消失（圖2b）；增加了異丙基乙酸酯、3-羥基丁酸乙酯[16]、甲酸丁酯和2-庚酮等具有水果香氣的物質，還有γ-丁內酯[17]、3-羥基-2-丁酮（乙偶姻）[18]和4-甲基噻唑等物質賦予了桑葉奶油和脂肪類香氣（圖2a）。

圖2 不同發酵時間桑葉揮發性物質指紋圖譜Fig.2 Fingerprint of volatile substances in mulberry leaves at different fermentation times

2.3 發酵桑葉過程中揮發性物質聚類分析

PCA 被廣泛應用于鑒別植物樣本的特征成分、揮發性物質和生物活性，其有效性也被廣泛證明，它能針對多個指標進行降維，轉換成幾個具有代表性的綜合指標[19]。如圖3 所示，兩個主成分累計貢獻率為85%，能較好地表示原始變量的特征差異，并能將未發酵、發酵3 d和發酵5～11 d 的桑葉進行區分，表明‘金花菌’發酵能明顯改變桑葉中的揮發性物質。

圖3 發酵桑葉過程中主成分分析Fig.3 Principal component analysis in fermentation of mulberry leaves

3 結論

將HS-GC-IMS 技術與PCA 結合，對‘金花菌’發酵桑葉過程中揮發性物質進行檢測和分析。結果共檢出揮發性物質45 種，主要有醇類10 種、醛類10 種、酯類9種、酮類8 種、醚、烯和酸類各2 種、烷烴和噻唑各1 種?！鸹ňl酵能使桑葉中苯甲醛甘油縮醛、硫丙醇、1-辛烯-3-醇、1-戊稀-3-酮和己醇等具有不良氣味的物質消失；增加異丙基乙酸酯、3-羥基丁酸乙酯、甲酸丁酯、2-庚酮、γ-丁內酯、3-羥基-2-丁酮和4-甲基噻唑等具有水果和奶油氣味的物質。PCA 能較好地區分未發酵、發酵3 d 和發酵5～11 d 的桑葉，該研究為桑葉風味改良和桑葉茶發酵提供參考。