釀酒酵母和異常漢遜酵母混合發酵黃酒工藝研究

鄭超群，陳 晨，蔣予箭，張 蕾，謝廣發

（1 浙江工商大學食品與生物工程學院 杭州310018 2 浙江樹人學院生物與環境工程學院 浙江省污染暴露與健康干預重點實驗室 杭州 310015）

黃酒是中國最古老的釀造酒，與葡萄酒、啤酒共同享有世界三大古酒的美譽[1]。黃酒是以稻米、黍米、小米等為主要原料，利用麥曲和部分酶制劑、酵母等糖化發酵劑釀造而成的發酵酒[2-4]。黃酒的酒精度低，一般含量為14% vol～20% vol，20 種氨基酸成分齊全，營養價值豐富，符合新時代消費者對食品安全、健康、營養的需求。然而，近年來黃酒的發展不盡如人意。據不完全統計，目前我國白酒的人均消費量為9 L 左右，啤酒的人均消費量為38 L 左右，而黃酒的人均消費量不足2 L[5]，黃酒市場仍有增長的空間，黃酒生產工藝與裝備的更新、新產品開發的工作還任重道遠。

釀酒酵母（S.cerevisiae）是黃酒釀造過程中的優勢菌種，其特點是發酵速度快，酒精轉化率高，發酵過程易于控制，對其它雜菌的抑制作用強，然而存在香氣成分不豐富等缺陷[6]。異常漢遜酵母（H.anomala）是一類與酒精發酵相關的天然非釀酒酵母，其代謝能力差，產酒精能力較低，通常不能獨自完成酒精發酵[7]。研究發現，非釀酒酵母能夠通過自身代謝活動生成醇或酯，或者通過胞外酶的釋放產生包括乙酯類、高級醇、甘油、揮發性酚類、芳香酮等一系列對黃酒質量有益的香氣物質，增加酒類香氣的復雜度和濃郁度[8-10]。Rojas 等[11]發現，有孢漢遜酵母（Hanseniaspora guilliermondii）、異常畢赤酵母（Pichia.anomala）與釀酒酵母的混合發酵獲得的乙酸酯類化合物比單一釀酒酵母發酵產品有明顯提高。Moreira 等[12]提出，將葡萄汁有孢漢遜酵母與釀酒酵母進行混合模擬自然發酵，結果酯類含量增加，提高了香氣復雜度。李婷[13]從川南白酒窖池中分離出1 株高產酯的非釀酒酵母，發酵畢赤酵母（Pichia fermentans）在40 ℃、pH 5 時，最大酶活力可達12.68 U/g，在提前0～96 h 接種處理的混菌發酵葡萄酒中檢出35 種香氣物質，總含量達70～194 mg/L。夏鴻川等[14]通過釀酒酵母和非釀酒酵母混合發酵試驗，發現混菌發酵處理提高了葡萄酒甘油產量0.38～1.11 g/L，同時降低了酒精含量0.33% vol～1.9%vol。Anfang 等[15]發現，克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）與釀酒酵母按照1 ∶1 接種混合發酵時，葡萄酒中硫醇類香氣物質的含量有所提高；按9∶1 進行混菌發酵時，葡萄酒中乙酸-3-巰基己醇的濃度增加。

本研究以釀酒酵母和異常漢遜酵母為發酵菌種，在比較2 種酵母的發酵特性以及對黃酒品質影響的基礎上，進行混菌發酵試驗?；炀l酵試驗包括同時混合發酵（CH）和順序混合發酵（SH）這兩種發酵途徑。在發酵過程中，測定酵母菌數、酒精度、還原糖、揮發酯等理化指標。在發酵結束后，對混菌發酵黃酒樣品進行感官評定。對篩選出的混合發酵路線，采用響應面分析法進行試驗設計與發酵工藝條件優化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米：北純糯米；糖化酶（酶活力1×105U/g，食品級）、液化酶（酶活力2×104U/g，食品級），河南萬邦實業有限公司；釀酒酵母，安琪黃酒專用活性干酵母；異常漢遜酵母1298，中國工業微生物菌種保藏管理中心（CICC）；麥曲，紹興古越龍山黃酒工程技術研究中心有限公司。

葡萄糖、氫氧化鈉、硫酸銅、亞鐵氰化鉀、酒石酸鉀鈉、亞甲基藍、鄰苯二甲酸氫鉀、無水乙醇、酚酞、甲基紅均為分析純級；鹽酸、硫酸、乳酸，國藥集團化學試劑有限公司；酵母增殖培養基（YPD）、孟加拉紅培養基，杭州微生物有限公司。

1.2 儀器與設備

HH-6 數顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；XSP-4C 顯微鏡，東莞市永先電子儀器有限公司；BXM-30R 立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業有限公司；NSKY-200B 恒溫培養振蕩器，上海蘇坤實業有限公司；3K30 臺式高速冷凍離心機，SIGAM Laboratory Centrifuges；Milli-Q 超純水處理系統，Millipore。

1.3 試驗方法

1.3.1 發酵試驗流程 見圖1。

圖1 發酵試驗流程圖Fig.1 Flow chart of fermentation experiment

1.3.2 糖化液的制備 將糯米打碎成糯米粉，粉碎后過60 目篩，備用，稱取糯米粉300 g，蒸餾水750 g（料水比為1∶2.5）加入到1 L 錐形瓶，混合均勻后，加入2 g 液化酶，在75 ℃水浴條件下，液化1 h，調節pH 4.5～4.8，加入1.5 g 糖化酶和30 g 麥曲（10%添加量），在65 ℃水浴鍋中糖化3 h，紗布過濾后，取上清液，正常情況糖度能達到20°Bx～25°Bx，95 ℃滅菌20 min，備用[16-17]。

1.3.3 酵母的擴培與計數

1.3.3.1 酯香酵母制備 挑取異常漢遜酵母1298斜面菌種，轉入YPD 液體培養基，于28 ℃，180 r/min 條件下培養18～20 h 至對數生長期，保證酯香酵母的工作濃度達到1×107個/mL 以上，低溫離心10 min 后（4 ℃，4 000 r/min）收集酵母菌體，經無菌水洗滌后，采用血球計數板進行酵母計數，在主發酵階段前，按接種比例接入純種酯香酵母發酵劑[18]。

1.3.3.2 釀酒酵母制備 稱取10 g 干酵母，加入150 mL 2%葡萄糖溶液，38 ℃水浴活化20 min，低溫離心（4 ℃，4 000 r/min）10 min 后，收集菌體，經無菌水洗滌，采用血球計數板進行酵母計數，按比例接種到糖化酵液中[19]。

發酵過程中采用平板計數法進行計數，培養基為孟加拉紅培養基[20-21]。

1.3.4 發酵條件 初始糖度18°Bx，溫度28 ℃，發酵20 d（主發酵5 d+后發酵15 d），發酵體量150 mL，其中釀酒酵母和異常漢遜酵母的的接種量都為1×107個/mL[22-23]。

1.3.5 發酵試驗設計 試驗組：接種釀酒酵母S.cere；接種異常漢遜酵母Han；同時接種混合發酵CH；順序接種混合發酵（接種漢遜酵母48 h 后接種釀酒酵母）SH[24]。

其中，釀酒酵母和異常漢遜酵母的接種量都為1×107個/mL，同時接種是指同時接入釀酒酵母和異常漢遜酵母同時進行酒精發酵，順序接種是指先接入異常漢遜酵母，48 h 后再接入釀酒酵母進行酒精發酵。

1.3.6 黃酒取樣檢測 主發酵第1，2，4 天，后發酵第7，12，16，20 天，分別取樣125 mL 濾紙過濾，4 ℃冰箱保存，備用。測定還原糖、酒精度、總酸、揮發酯、酵母菌數等理化指標。

1.3.7 理化指標的測定 酒精度、總酸的測定參照GB/T 13662-2018[25]；還原糖的測定參照GB 5009.7-2016[26]中的亞鐵氰化鉀滴定法；揮發酯的測定參考國家標準GB/T 17946[27]中的回流皂化法。酵母菌數的測定：血球計數法[28]、平板計數法參考GB/T 4789.2-2016[29]。

1.4 工藝優化設計

1.4.1 單因素實驗設計 按照工藝路線進行發酵試驗，并對以下單因素進行相關參數替換。初始還原糖含量：250，220，190，160，130 g/L，可使用葡萄糖調節；初始pH 值：3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，參考文獻[30]使用檸檬酸、小蘇打調節；主發酵溫度：26，28，30，32，34 ℃；接種量（酯香酵母∶釀酒酵母為1 ∶1）：0.5×107，1.0×107，1.5×107，2.0×107，2.5×107個/mL。每個發酵組做3 次平行，取平均值。以發酵結束后的揮發酯、酒精度為評價指標。

1.4.2 響應面設計 在單因素實驗的基礎上，選擇對黃酒順序發酵揮發酯含量影響較大的3 個因素（包括初始pH、酵母接種量、主發酵溫度）根據Box-Benhnken 中心組合試驗設計原理，采用3 因素3 水平1 響應值響應面分析法進行設計。

選定初始pH、酵母接種量、主發酵溫度范圍分別為pH 3.5～4.9，0.5～1.5×107個/mL，30～34 ℃，響應面的分析因素及水平設計如表1 所示。

表1 響應面分析因素與水平Table 1 Response surface analysis factors and levels

1.5 感官評定

9 名感官評定人員先經過3 輪品評專業培訓。使用計分評價法對酒樣進行感官評價，以篩選出感官品質最優的黃酒樣品。本次感官評價參考黃酒國家標準（GB/T 13662-2018）[25]，制定發酵酒的感官評分表（見表2），滿分是100 分，其中色澤10 分，香氣25 分，口味50 分，風格15 分。根據品評酒樣的色澤、香氣、味道、風格的優劣差異的評語情況，依規定項目的分數進行打分。

表2 黃酒感官評分表Table 2 Yellow rice wine sensory score

1.6 數據處理

數據采用Excel，Origin 9.0，Design Expert 8.0.6 軟件處理、繪圖。

2 結果與分析

2.1 兩株酵母發酵特性比較

2.1.1 兩株酵母單獨發酵過程理化指標變化 釀酒酵母和異常漢遜酵母發酵過程中理化指標的變化如圖2～4 所示，對發酵結束后的理化指標進行統計，結果見表3。

表3 發酵結束后各理化指標Table 3 Physical and chemical indicators after fermentation

圖2 酵母單獨發酵過程還原糖（a）和酒精度（b）的變化Fig.2 Changes in reducing sugar（a）and alcohol content（b）during yeast fermentation alone

圖2 和圖3 分別為釀酒酵母和異常漢遜酵母發酵過程中理化指標的變化，包括還原糖、酒精度、總酸、揮發酯，圖4 為酵母數的變化。由圖2 可以看出，釀酒酵母發酵的還原糖含量急劇下降，僅2 d 下降至7.0 g/L，同時酒精度含量達到9.3% vol，第7 天酒精度達到最高值10.7% vol，之后緩慢下降。異常漢遜酵母的還原糖含量在整個發酵過程中呈逐步下降的趨勢，發酵結束后，還原糖含量與釀酒酵母差異不大，說明異常漢遜酵母的還原糖代謝能力不低于釀酒酵母。同時，發酵過程中異常漢遜酵母的酒精度含量始終低于釀酒酵母，說明異常漢遜酵母的酒精轉化能力較差。由圖3 可知，在發酵過程中，異常漢遜酵母的產酸能力明顯強于釀酒酵母，在發酵第16 天達到最大值5.6 g/L，之后出現下降，推測發酵后期有機酸會與醇類物質發生酯化反應，生成乙酯類化合物，導致總酸含量下降，同時，可以看出異常漢遜酵母的揮發酯含量一直在增加，第16 天達到最大值2.67 g/L，而釀酒酵母的揮發酯含量增加緩慢，變化不大，發酵結束后，釀酒酵母和異常漢遜酵母的揮發酯含量分別為0.53 g/L 和2.41 g/L，異常漢遜酵母的揮發酯含量是釀酒酵母的4.5 倍。說明異常漢遜酵母的產酯能力明顯強于釀酒酵母的產酯能力。由圖4可以看出，釀酒酵母前期的增殖速度較快，第2 天達到最大值1.61×108CFU/mL，之后呈下降趨勢；異常漢遜酵母在發酵前4 天增殖速度最快，在第12 天達到最大值1.15×108CFU/mL 時進入平衡期，后期糖類等碳源物質逐漸消耗殆盡，酵母菌缺少營養物質，進入衰亡期。

圖3 酵母單獨發酵過程總酸（a）和揮發酯（b）的變化Fig.3 Changes in total acid（a）and volatile esters（b）during yeast fermentation alone

從表3 看出，發酵結束后，釀酒酵母與異常漢遜酵母發酵液中的還原糖含量都在10 g/L 以下，說明兩者糖代謝都比較徹底。發酵結束時釀酒酵母的酒精度高于異常漢遜酵母，揮發酯含量低于異常漢遜酵母，顯然釀酒酵母產酒精能力較強，異常漢遜酵母產揮發酯能力較強。

2.1.2 酵母單獨發酵黃酒感官評價結果 對不同發酵方式的黃酒進行感官品評，總分以各項分累計而得，結果見表4。

表4 不同發酵方式黃酒感官評價結果Table 4 Sensory evaluation results of yellow rice wine with different fermentation methods

發酵結束后，對兩種酵母菌單獨發酵的黃酒樣品進行感官評價，從色澤、口味、香氣、風格4 個方面對黃酒樣品進行打分，由表4 可以看出，兩種酵母單獨發酵黃酒的差異主要體現在色澤和香氣成分上，釀酒酵母發酵的黃酒樣品顏色較淡，而異常漢遜酵母發酵的黃酒樣品呈現出色澤較好的琥珀色。另外，異常漢遜酵母由于產揮發酯的特性，所以其發酵的黃酒樣品香氣成分濃郁，強烈。從口味上來說，釀酒酵母的酒味明顯強于異常漢遜酵母。綜合來看，異常漢遜酵母發酵的黃酒樣品得分高于釀酒酵母發酵的黃酒樣品。

2.2 混合酵母發酵路線的篩選

2.2.1 混合酵母發酵過程變化

2.2.1.1 酵母混合方式對酵母生長量的影響 圖5 可知，釀酒酵母和異常漢遜酵母同時混合接種發酵，異常漢遜酵母處于劣勢地位，4 d 后，平板計數中檢測不出異常漢遜酵母菌，說明釀酒酵母對異常漢遜酵母起到強烈的抑制作用[31]?？梢钥闯?，在順序混合發酵條件下，前期異常漢遜酵母具有先發優勢，增殖速度較快，形成菌種優勢，對釀酒酵母的增殖起一定壓制作用。4 d 后，釀酒酵母逐漸適應發酵條件，增殖數大于異常漢遜酵母，異常漢遜酵母菌種優勢下降，釀酒酵母占據發酵優勢地位。

圖5 同時混合靜置（a）和順序混合靜置（b）發酵期間酵母數變化Fig.5 Changes in yeast number during fermentation with simultaneous mix-and-stand（a）and sequential mix-and-stand（b）

2.2.1.2 酵母混合方式對發酵過程理化指標及產揮發酯量的影響 從圖6 和圖7 可以看出，在發酵前2 天，CH（同時混合發酵）消耗還原糖的速率遠遠大于SH（順序混合發酵）還原糖的速率，這是因為前2 天，釀酒酵母大量生長繁殖，還原糖等碳源營養物質被大量吸收利用，通過EMP 代謝途徑產生大量酒精。發酵結束后，SH 和CH 的還原糖含量均低于10 g/L，說明發酵代謝徹底，還原糖轉化率高。發酵過程中CH 的酒精度始終高于SH 的酒精度，說明釀酒酵母的酒精轉化率高，SH 揮發酯含量顯著高于CH 的揮發酯含量，這是因為CH在發酵過程中，異常漢遜酵母競爭力太差，導致發酵中后期，以釀酒酵母為主體發酵菌種。結束后，SH 的酒精度（8.1%vol）略低于CH 的酒精度（8.7%vol）。CH 和SH 最終總酸含量分別為3.1 g/L 和4.7 g/L，揮發酯含量分別為0.56 g/L 和1.59 g/L，SH 揮發酯含量顯著高于CH 揮發酯含量。

圖6 不同混合條件黃酒發酵期間還原糖（a）和酒精度（b）的變化Fig.6 Changes in reducing sugar（a）and alcohol content（b）during fermentation of yellow rice wine with different mixing conditions

圖7 不同混菌條件黃酒發酵期間總酸（a）和揮發酯（b）的變化Fig.7 Changes of total acid（a）and volatile ester（b）during fermentation of rice yellow wine under different mixed conditions

2.2.2 酵母混合方式對黃酒發酵產品感官的影響發酵結束后，對黃酒樣品進行感官評定，從色澤、口味、香氣、風格4 個方面對黃酒樣品進行打分，根據感官評價結果，由表5 可知，SH 黃酒的綜合感官得分高于CH 黃酒。SH 具有濃郁的酒香味，口味醇和、爽口的特點。CH 黃酒具有酒味不醇厚，香氣不明顯的特點。因此，可以將SH 路線作為黃酒新工藝研究方向，改善黃酒風味和口感。

表5 黃酒感官評價結果Table 5 Sensory evaluation results of yellow rice wine

2.3 發酵工藝優化

2.3.1 單因素實驗結果與分析 由圖8 可知，隨著初始還原糖含量的增加，酒精度呈逐步上升的趨勢，而揮發酯含量在逐步下降，當還原糖含量高于220 g/L 時，揮發酯含量趨于穩定，說明還原糖含量偏高時，不利于酯類等物質的生成，使得發酵黃酒揮發酯含量偏低；而酒精度隨還原糖含量的增加而增加，說明發酵徹底，酒精轉化率高。由此，可以選擇一個合適的含糖量（160 g/L），使發酵黃酒的酒精度含量不能過低，并且可以增加揮發酯的含量，增加香氣成分。

圖8 初始還原糖濃度對發酵黃酒酒精度和揮發酯含量的影響Fig.8 Effect of initial reducing sugar concentration on alcohol content and volatile ester content of fermented yellow rice wine

由圖9 可知，當發酵溫度在26～34 ℃，溫度對發酵黃酒最后的酒精度含量影響不顯著，說明在這個溫度范圍內，釀酒酵母具有較強的發酵酒精能力。發酵溫度在32 ℃時，揮發酯的含量達到最高值1.70 g/L。發酵溫度過高或者過低都會影響最后揮發酯的含量。這可能是因為溫度過高或者過低都不利于產酯酵母的生長繁殖，從而使得最終生成的揮發酯含量下降。另外，發酵溫度過高也不利于香氣成分等小分子物質保留，使得最終的揮發酯含量略低。綜上考慮，發酵溫度為32 ℃較為合適。

圖9 主發酵溫度對發酵黃酒酒精度和揮發酯含量的影響Fig.9 The effect of main fermentation temperature on the alcohol content and volatile ester content of fermented yellow rice wine

由圖10 可知，當pH 值為4.5 時，酒精度含量最高達到8.9% vol。pH 值為4.0 時，揮發酯的含量最高，為1.64 g/L。pH 值的高、低都會影響異常漢遜酵母的生長代謝，使得最后生成的揮發酯含量有所不同。當pH 值含量為4.0 時，酒精度的含量也大于8.0% vol，達到低度黃酒國家標準的酒精度要求。綜合考慮，選擇初始發酵pH 值為4.0比較合適。

圖10 初始pH 值對順序發酵黃酒酒精度和揮發酯含量的影響Fig.10 Effect of initial pH value on alcohol content and volatile ester content of sequentially fermented yellow rice wine

由圖11 可知，不同接種量條件對發酵黃酒最終酒精度含量的影響并不顯著。揮發酯含量隨著接種量的增加呈先增大后減小的趨勢。接種量在1.0×107個/mL 時，揮發酯含量最高，達到1.72 g/L。當初始接種量過小時，影響發酵的啟動速度，效率過低。接種量過高時，則由于糖類等初始營養物質消耗過快，不利于酯類物質的積累。綜合考慮，選擇接種量為1.0×107個/mL，比較適合黃酒發酵。

圖11 接種量對順序發酵黃酒酒精度和揮發酯含量的影響Fig.11 Effect of inoculum size on alcohol content and volatile ester content of sequentially fermented yellow rice wine

2.3.2 響應面試驗結果與分析 在單因素實驗結果的基礎上，確定主發酵溫度（A）、pH 值（B）、接種量（C）為考察自變量，以揮發酯含量為響應值，用Design-Expert V8.0.6 統計分析軟件設計BoxBehnken 響應面試驗，共設計3 因素3 水平，共17 個試驗組別，試驗結果見表6。

表6 響應面分析法試驗方案及結果Table 6 Experimental scheme and results of response surface methodology

通過軟件分析擬合，以揮發酯含量為響應值，得到順序發酵黃酒揮發酯含量對主發酵溫度（A）、pH 值（B）、接種量（C）的二次回歸方程為：揮發酯=1.69-0.053A-0.026B-0.031C-0.005AB-0.020 AC+0.048BC-0.12A2-0.10B2-0.13C2。

從表7 和表8 可以看出，模型的P 值＜0.0001，說明該回歸模型達到極顯著水平，失擬項的P 值為0.1750＞0.05，表明模型失擬項不顯著；決定系數R=0.9808，表明98.8%的數據可以用這個方程來解釋；信噪比為17.723＞4；變異系數為1.67%＜15%；以上分析均說明該回歸模型與試驗擬合良好，可以用于對順序發酵黃酒的揮發酯含量的預測分析。

表7 揮發酯回歸方差模型分析Table 7 Analysis of volatile ester regression variance model

表8 模型可行性分析Table 8 Model feasibility analysis

本模型因素一次項A（P＜0.01）為極顯著水平，B 和C（0.01＜P＜0.0）為顯著水平；二次項A2、B2、C2均為極顯著水平（P＜0.01）；交互項BC 為極顯著水平（P＜0.01），AB 和AC 均不顯著（P＞0.05），從主發酵溫度（A）、pH 值（B）、接種量（C）3 個影響因素的F 值可知，各單因素對發酵黃酒揮發酯含量的影響大小依次為：A（33.89）＞C（12.01）＞B（8.47）。

2.3.2.1 模型討論與分析 響應面是以響應值對各試驗因子所構成的三維空間的曲面圖[32]。通過用Design expert 8.06 軟件分析，得出主發酵溫度、pH 值和酵母接種量交互作用對黃酒揮發酯含量影響的響應曲面和等高線，結果如圖12 所示。

圖12 各因素間交互作用對黃酒揮發酯含量影響的響應面圖和等高線圖Fig.12 Response surface and contour map of the interaction between factors on the content of volatile esters in yellow rice wine

響應面中的最高點是等高線最小橢圓的圓心，并且圖形的曲面越陡峭，說明兩因素之間的交互作用越明顯。相反，圖形的曲面越平緩，說明兩因素的交互作用越小。等高線的形狀可以表示因素之間的交互作用的顯著程度，等高線的形狀越接近橢圓形，表明兩因素的交互作用顯著；相反，形狀越接近圓形，表面相互作用不顯著[33]。由圖12可知，曲面圖形開口均向下，存在極值。從圖中可以看出，溫度對于SH 黃酒的揮發酯含量影響最大，A（發酵溫度）和B（pH 值）的等高線趨于圓形，交互作用不顯著；而A（發酵溫度）和C（接種量）與B（pH 值）和C（接種量）的曲面形狀較為陡峭，等高線近于橢圓形，說明兩因素間的交互作用顯著。從圖中也可看出，發酵溫度對揮發酯含量的影響大于pH 值、接種量；接種量對揮發酯含量的影響大于pH 值。因此，各因素影響揮發酯含量的順序依次為：發酵溫度＞接種量＞pH 值，與方差結果分析一致，說明模型的可靠性較高。

2.3.2.2 驗證試驗 通過Design-Expert 8.0.6 對方程求解，得到順序發酵黃酒的最佳工藝：發酵溫度為31.58 ℃，接種量為0.93×107個/mL，pH 值為4.18。在此條件下，揮發酯含量的理論值為1.70 g/L。同時考慮到實際操作的可行性，修正最佳工藝的條件為：溫度31.5 ℃，接種量為1.0×107個/mL，pH 值為4.2。在此條件下進行平行試驗3 次，得到發酵黃酒結束后的揮發酯含量為1.66 g/L，準偏差為0.028，與理論值相差不大，說明試驗模型可靠，試驗結果理想。在此條件下，測得發酵結束后的理化指標，酒精度8.0% vol，還原糖含量9.32 g/L，總酸含量4.32 g/L，綜合感官評價得分為82.6。

3 結論

本研究對2 種酵母發酵過程中理化指標進行跟蹤檢測，并對發酵結束后的黃酒樣品進行感官評價，發酵結束后，釀酒酵母和異常漢遜酵母的酒精度分別為9.9% vol 和6.8% vol，揮發酯含量分別為0.53 g/L 和2.41 g/L，異常漢遜酵母的揮發酯含量是釀酒酵母含量的4.5 倍，含量顯著高于釀酒酵母，且香氣較為濃郁。對2 種酵母進行混菌發酵途徑篩選，顯示順序混合發酵路線能有效提高黃酒中揮發酯含量，選擇順序混合發酵路線較為合適。

通過使用軟件Design-Expert 8.0.6 對主發酵溫度、pH 值、接種量3 個因素以揮發酯為響應值進行優化。結果顯示，最佳發酵工藝為：發酵溫度31.5 ℃，pH 值4.2，接種量1.0×107個/mL。在此條件下進行3 次平行試驗，得到揮發酯含量為1.66 g/L。同時測得理化指標：酒精度8.0% vol，還原糖含量9.32 g/L，總酸含量4.32 g/L，符合黃酒國標GB/T 13662-2018 中清爽型干黃酒理化要求，綜合感官評價得分為82.6。在保證順利發酵的情況下，增加了非釀酒酵母的優勢，提高了黃酒中揮發酯含量，增加更多香氣成分，改善了黃酒的品質和風味，具有一定的現實意義。