實時熒光跨越式滾環等溫擴增技術檢測蜂蜜摻偽大米糖漿

楊 浩，徐 慧，李欣妍，盧 鑫，楊 倩，張 偉，3，4*

（1 河北農業大學食品科技學院 河北保定071000 2 河北農業大學理工系 河北滄州061100 3 河北農業大學生命科學學院 河北保定071000 4 河北省人畜共患病原微生物分析與防控重點實驗室 河北保定071000 5 河北大學公共衛生學院 河北保定 071000）

蜂蜜是蜜蜂從各種植物分泌物中釀造產生的天然甜味物質，具有較高的營養價值和良好的感官性能[1]。隨著國內外對蜂蜜需求量日益增加，蜂蜜的市場供不應求[2]。在巨大的利益驅動下導致其摻偽現象嚴重[3]。這不僅損壞消費者利益，而且沉重打擊了合規蜂企和蜂農的利益。目前市場中約有90%的蜂蜜摻偽與甜味劑有關，最常見的為大米糖漿[4]。由于蜂蜜摻偽鑒別難度大，現有的檢測技術很難做到簡便、快速的鑒別[4-5]，且國內外對于蜂蜜摻偽的檢測標準并不完善，因此，開發一種簡單、快速的檢測蜂蜜摻偽方法成為研究熱點。

近年來，許多分析技術被用于蜂蜜的真實性檢測[6-7]。核磁共振法（Nuclear magnetic resonance，NMR）被認為是最有效的方法之一[8]，然而其成本高，耗時長。氣相色譜-質譜（Gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）[9]、高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）[10]這些方法在應用于熱處理食品檢測時存在一定局限，且步驟繁瑣，不能滿足快速檢測要求。近紅外光譜技術（Near infra-red spectroscopy，NIRS）[11-13]、傅里葉變換拉曼光譜（Fourier transform-Raman spectroscopy，FTRS）[14-15]、穩定性碳同位素質譜（Stable carbon isotope mass spectrometry，SCIMS）[16]等技術都需要專業的操作人員，限制了其在常規檢測中的應用?；贒NA 檢測的聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）、實時熒光定量PCR 已在蜂蜜摻偽檢測中得到應用。如Sobrino-Gregorio 等[17]通過實時PCR 定量檢測蜂蜜摻偽大米糖漿的相對靈敏度為2%～5%，靈敏度高，特異性良好，然而反應需要復雜的變溫過程。隨著分子生物學技術的發展，核酸等溫擴增技術發展迅速。

本研究團隊基于Bst 酶擴增DNA 的一個新特性，創建了跨越式滾環等溫擴增技術，其原理如圖1 所示。與滾環擴增（Rolling circle amplifification，RCA）相比[18-19]，SRCA 省時、簡便，無需人為環化模板；與環介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）相比[20-21]，不需要設計復雜的引物，僅需1 對引物便可完成對線性DNA 的擴增，已在摻偽檢測方面得到應用，如可視化SRCA 檢測羊肉中鴨肉源成分[22]，豬肉摻偽檢測[23]等肉類產品的真實性評估。本研究針對3種DNA 提取方法，優選最佳DNA 提取方法。以大米的4 種特異性基因（PDL、SPS、rbcL、GOS9）為靶序列篩選適宜的引物。將SRCA 與熒光技術相結合，建立檢測蜂蜜摻偽大米糖漿的方法，為蜂蜜摻假的快速檢測提供新方法。

圖1 SRCA 原理圖Fig.1 SRCA schematic

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5 種植物糖漿（大米糖漿、玉米糖漿、甜菜糖漿、麥芽糖漿、甘蔗糖漿）、槐花蜂蜜均購于當地大型市場與電商平臺；商業試劑盒“NucleoSpin Food”，基因生物技術國際貿易（上海）有限公司；深加工食品DNA 提取試劑盒（Processed food DNA Extraction Kit），上海冀杰生物科技有限公司；Bst DNA 聚合酶及其緩沖液，大連寶生物工程有限公司；EvaGreen 熒光染料，上海開放生物科技有限公司；磷酸鹽（PBS）緩沖液、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等購于當地試劑公司。

1.2 儀器與設備

熒光定量PCR 儀，中國Archimed Analyzer 公司；TGL16A 臺式離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；DXY-33A 型電泳儀，北京六一儀器廠；StepOnePlus qPCR 儀，美國Applied biosystems 公司；H1850R 臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；Nanodrop 2000 核酸蛋白測定儀，Gene company Limited 基因有限公司。

1.3 DNA 的提取

使用合適的DNA 提取方法，提取出較高產量與純度的DNA 是SRCA 成功的關鍵[17，24]。對比3種DNA 提取方法（改良的深加工食品DNA 提取試劑盒、改進的CTAB 法、“NucleoSpin Food”商業試劑盒[25]）。在預處理的過程中，CTAB 沉淀液具有沉淀DNA 的作用，加之糖漿液體比較黏稠，結果并不理想，因此，采用PBS 緩沖液對樣品進行預處理，因其具有調節鹽平衡、調節適宜pH 值、保護溶液生物活性物質的特點。準備大米糖漿樣品48 mL，分裝于6 個50 mL 的離心管中（每管8 mL），經PBS 緩沖液預處理，對比3 種方法，分別進行DNA 的提取。將提取的模板DNA 經2%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀的紫外光下觀察電泳條帶。

1.4 DNA 濃度與純度的測定

對于深加工產品而言，提取的DNA 需要消除SRCA 反應的抑制劑，才可用于后續SRCA 反應[17]。用分光光度計測定大米基因組DNA 濃度和純度（A260/280），當純度（A260/280）在1.8～2.1 之間時，可用于SRCA 反應，如表1 所示。最后-20 ℃保存水稻基因組DNA，備用。

表1 水稻引物組信息Table 1 Rice primer set information

1.5 引物的設計與篩選

大米糖漿的DNA 在加工過程中會高度裂解，為確保檢測結果的準確性，選擇具有種內保守性、種間特異性的大米基因；為保證目的序列的完整性，在NCBI 中分別選擇大米的4 種特異性基因（PDL、SPS、rbcL、GOS9）為靶序列設計引物，在BLAST 上進行同源性比對，使用DNAMAMN 軟件設計引物，引物序列詳細信息見表1。

1.6 實時熒光SRCA 的反應體系和條件

實時熒光SRCA 反應總體系為20 μL，包括MgSO4（20.0 mmol/L）3 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）5 μL，10×ThermoPol Reaction Buffer 2.0 μL，正反向引物（1 μmol/L）1 μL，大米模板DNA 為1 μL，Bst DNA 聚合酶（8 000 U/mL）1.5 μL，無菌去離子水4.5 μL，EvaGreen 熒光染料1 μL。將大米DNA 模板置于94 ℃條件下，預變性3 min，加入反應體系混合液與EvaGreen 熒光染料，利用熒光定量PCR儀進行反應，62 ℃反應40 min，設置每1 min 執行采集1 次熒光信號值，隨后在80 ℃條件下放置5 min，防止反應繼續發生，最后置于4 ℃冰箱以終止反應。

1.7 SRCA 擴增產物的序列分析

將SRCA 擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察紫外光下的電泳條帶得到結果。電泳結束后切取膠塊底部3 條DNA 片段，進行純化、連接、轉化，送往華大基因公司測序分析。

1.8 實時熒光SRCA 定量檢測方法的優化

在預試驗反應體系的基礎之上，通過單因素實驗進行反應體系與反應條件的優化。反應體系中添加EvaGreen 熒光染料[26]，采用實時熒光SRCA 進行添加量梯度的優化方式，分別對Mg2+添加量（1，2，3，4，5 μL）、反應溫度（60，61，62，63，64℃）、酶的添加量（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 μL）、dNTPs的添加量（3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 μL）進行優化，設置每1 min 執行采集1 次熒光信號值。

1.9 實時熒光SRCA 特異性試驗

將5 種植物糖漿（玉米糖漿、甜菜糖漿、麥芽糖漿、甘蔗糖漿、大米糖漿）進行基因組DNA 的提取，每種植物糖漿分別準備5 份不同樣品，并在上述最適的反應條件下，進行實時熒光SRCA 反應，通過擴增曲線驗證樣品，以評估實時熒光SRCA定量方法檢測蜂蜜中大米糖漿成分的特異性，每個樣品重復3 次。

1.10 實時熒光SRCA 靈敏度及檢出限試驗

為了評估SRCA 檢測方法的靈敏度，利用無菌、無酶水對大米模板DNA 進行梯度稀釋，其初始質量濃度為84.5 ng/μL，然后采用10 倍梯度稀釋法，將大米模板DNA 依次稀釋至8.45×107～8.45×100fg/μL，通過實時熒光SRCA 對大米模板DNA 的系列稀釋液進行檢測，以評價該方法的靈敏度，每個樣品重復3 次。

1.11 人工模擬摻偽檢測試驗

為了驗證實時熒光SRCA 定量方法對檢測蜂蜜摻偽大米糖漿的實用性，進行人工模擬摻偽檢測試驗。在純槐花蜂蜜中摻入不同比例的純大米糖漿，按照相應的摻偽質量分數（0.5%，1%，5%，10%，20%，50%）進行評估，通過實時熒光SRCA對不同摻偽比例的混合樣品進行定量檢測，每個樣品重復3 次。

2 結果與分析

2.1 DNA 提取方法的選擇

蜂蜜與大米糖漿中的高碳水化合物和酚類化合物的存在是影響DNA 提取與擴增的主要因素，酚類化合物被氧化后與DNA 結合形成不可逆復合物，使提取的DNA 活性降低；高碳水化合物如多糖，易形成膠狀物，很難從DNA 中完全分離出來，DNA 洗脫液中殘留的多糖成分，會賦予洗脫液一定的黏性，從而抑制聚合酶、限制性內切酶等多種生物酶的活性，因此，DNA 提取方法的優選，直接影響該方法的實用性[27-29]。

通過對比3 種DNA 的提取方法，提取大米糖漿Ⅰ與大米糖漿Ⅱ的模板DNA，獲得的瓊脂糖凝膠圖像，結果如圖2 所示。泳道2 與泳道5 為改良的CTAB 方法提取大米糖漿Ⅰ與大米糖漿Ⅱ的模板DNA，出現了較淺的DNA 條帶；泳道1 與泳道4 為改良的深加工食品DNA 提取試劑盒對大米糖漿Ⅰ與大米糖漿Ⅱ模板DNA 的提取，出現了較明顯的DNA 條帶；泳道3 與泳道6 為商業試劑盒提取方法，在大米糖漿Ⅰ與大米糖漿Ⅱ的模板DNA 提取結果檢測中均出現明顯的DNA 條帶。如表2 所示，為使用分光光度劑測量3 種方法提取DNA 的濃度與純度（A260/280）。結果表明，相比其它2 種方法，商業試劑盒方法提取大米DNA 更高效。

表2 DNA 質量濃度與純度測定Table 2 DNA mass concentration and purity were determined

圖2 模板DNA 膠圖Fig.2 Template DNA glue diagram

2.2 引物的篩選

使用4 種特異性引物（PDL、SPS、rbcL、GOS9）對3 種方法提取的DNA 進行SRCA 反應。如表3所示。改良的CTAB 方法提取的大米DNA 進行實時熒光SRCA 反應時，4 組引物均未出現擴增現象，說明該方法提取的大米DNA 不適用于SRCA擴增反應，故舍棄。

表3 SRCA 引物的篩選Table 3 Screening of SRCA primers

改良的深加工食品DNA 提取試劑盒提取的大米DNA 進行實時熒光SRCA 反應時，PDL、SPS、GOS9 引物對大米糖漿Ⅰ的模板DNA 出現了擴增現象，且PDL 引物的Ct 值最小，GOS9 引物的Ct 值最大，對大米糖漿Ⅱ的模板DNA 檢測中，只有PDL 引物與GOS9 引物產生擴增結果，SPS引物并未擴增，結果可能是大米糖漿Ⅱ在加工處理過程中因加熱導致DNA 降解現象較為嚴重，或改良的深加工食品DNA 提取試劑盒提取DNA 采用非離心柱的分離方式，操作過程中雜質分離不徹底，模板DNA 中殘留少量的DNA 反應抑制劑，對SRCA 反應起抑制作用。

商業試劑盒提取的大米DNA 進行實時熒光SRCA 反應時，PLD、SPS、GOS9 引物對大米糖漿Ⅰ與大米糖漿Ⅱ的模板DNA 均產生擴增現象。PDL引物的Ct 值均最小，GOS9 引物的Ct 值最大。rbcL引物對大米糖漿（I 和II）均未顯示擴增結果，因此該引物特異性較差。結果表明，相比于其它3 種引物，PLD 引物具有良好的特異性。

2.3 SRCA 反應條件優化

采用實時熒光SRCA 進行反應體系與反應條件的優化。結果如圖3 所示，當Mg2+添加量為3 μL，熒光曲線的Ct 值最小，擴增效率最高；當反應溫度為62 ℃，熒光曲線的Ct 值最小，具有最好的酶活性；Bst DNA 聚合酶的最適添加量1.5 μL；dNTPs 的最適添加量為5.0 μL。

圖3 SRCA 反應體系與反應條件優化Fig.3 Optimization of SRCA reaction system and reaction conditions

2.4 測序結果分析

如圖4 所示，SRCA 擴增條帶為梯形條帶，結果與目的片段一致，為進一步驗證結果的準確性，進行測序分析，測序結果藍色代表正向引物（FWP），紅色代表反向引物（RVP）的反向互補序列，目的序列片段長度為82 bp。隨機添加序列為4 bp，產物為含有目的序列的串聯重復片段，結果表明，SRCA 的擴增產物與大米PLD 靶區匹配良好。

2.5 特異性試驗

由圖5 可知，5 種大米糖漿樣品檢測到了擴增信號，判定為陽性，其它植物糖漿樣品（玉米糖漿、麥芽糖漿、甜菜糖漿、甘蔗糖漿）均未出現擴增曲線，即未發生擴增反應，判定為陰性，結果表明，該方法具有良好的特異性，可用于大米糖漿成分的鑒定。

2.6 靈敏度及檢出限試驗

由圖6a 可知，當大米DNA 質量濃度為8.45×107～8.45×101fg/μL 時，可檢測到大米DNA 的熒光擴增信號，且Ct 值逐漸增大；當DNA 質量濃度為8.45×100fg/μL 時，沒有產生擴增曲線，即未發生擴增反應，因此該檢測方法的靈敏度為84.5 fg/μL，由于大米糖漿在加工處理的過程中，造成DNA 降解的現象較為嚴重，然而其仍具有良好的靈敏度。如圖6b 所示，大米DNA 質量濃度的對數與Ct 值存在線性關系，線性方程為y=-2.209x +27.438（R2=0.995），結果表明，該方法檢測大米DNA 具有良好的靈敏度。

圖6 靈敏度分析Fig.6 Sensitivity analysis

2.7 人工模擬摻偽試驗

圖7a 為純槐花蜂蜜和摻入不同百分比純大米糖漿的實時熒光SRCA 結果圖像。對蜂蜜中人工摻偽大米糖漿的不同質量比例（0.5%，1%，2%，5%，10%，20%，50%）進行評估，對混合樣品的大米糖漿含量進行定量檢測，摻偽質量比與其對應Ct 值如下：50%（9.981），20%（12.340），10%（14.510），5%（16.122），2%（18.435），1%（21.055），0.5%（0），質量比在50%～1%時，產生熒光信號，且Ct 值逐漸增大，摻假比例在0.5%時，未產生熒光信號，說明不能區分0.5%的摻偽率，而可以檢測到1%的摻假率，因此，該方法可以檢測到蜂蜜中大米糖漿的摻假水平為1%。如圖7b 所示，質量比的對數與其對應的Ct 值線性關系良好，建立的線性方程y=6.618x+7.651，相關系數R2=0.993，線性關系良好。相比于Sobrino-Gregorio 等[17]通過實時PCR 檢測蜂蜜中大米糖漿（定量水平為2%～5%），實時熒光SRCA 靈敏度更高，因為SRCA 檢測方法能夠擴增較小的DNA 片段（60～120 bp）或高度降解的DNA[1]。

圖7 人工模擬摻偽檢測及檢出限測定Fig.7 Artificial simulation detection of adulteration and detection limit

3 結論與討論

蜂蜜與大米糖漿中高碳水化合物、酚類化合物的存在是影響DNA 提取與擴增的主要因素[30]。在預處理過程中，CTAB 沉淀液具有沉淀DNA 的作用，而糖漿制品的DNA 破壞比較嚴重，而且糖漿液體比較黏稠，提取效果并不理想，PBS 緩沖液具有調節適宜pH 值、調節鹽平衡、保護溶液生物活性物質的特點。因此，采用PBS 緩沖液進行樣品預處理，并評估3 種DNA 提取方法，對比結果表明，商業試劑盒“NucleoSpin Food”的DNA 提取效率最好，且操作簡單，用時更少。大米特異性基因的選擇同樣是實時熒光SRCA 檢測植物源成分的關鍵。本研究以4 種特異性基因為靶序列，分別設計引物，結果表明，在大米PDL 的特異性基因上設計的引物效果最好，經特異性試驗證實引物的特異性良好。

本研究構建了實時熒光SRCA 技術定量檢測蜂蜜摻偽大米糖漿的方法，靈敏度試驗表明，該方法檢測到大米DNA 的靈敏度為8.45×101fg/μL，人工摻偽樣品檢測試驗表明，該方法可準確檢出蜂蜜中低至1%的大米糖漿成分，建立的線性方程為y=6.618x+7.651（R2=0.993），相比于實時PCR[3]可檢測摻偽比例為2%～5%，SRCA 具有更高的靈敏度，因為SRCA 可擴增DNA 片段長度60～120 bp 或高度裂解的DNA，目前在蜂蜜摻偽植物糖漿檢測方法中很難檢出低于10%的植物糖漿成分。因此，該方法具有更低的定量檢出限。綜上所述，SRCA 技術可用于蜂蜜摻偽的定量檢測，具有良好的特異性和更高的靈敏度。整套檢測僅需2.5 h，耗時短，為蜂蜜摻偽的快速定量檢測提供了一種新策略。