橘汁發酵過程中柑橘香氣及其貢獻化合物的分析

陳小華，黃 微，黨亞鋒，朱 瑜，耿敬章，金文剛

（1 陜西理工大學生物科學與工程學院 陜西省資源生物重點實驗室 陜南秦巴山區生物資源綜合開發協同創新中心秦巴生物資源與生態環境省部共建國家重點實驗室（培育） 陜西漢中723001 2 漢中市食品藥品監督檢驗檢測中心 陜西漢中 723000）

柑橘是世界第一大類水果，我國是全球最大的柑橘主產國，柑橘產量占全球總產量的27%，年產量超過3 000 萬t，占全國水果產量的21%[1-3]。柑橘產業作為我國長江中、上游地區農業支柱產業和綠色經濟的重要組成部分，在改善生態環境，提高橘農收入及出口創匯中均扮演著重要角色。近年來，隨著我國柑橘產量的不斷提高，柑橘初加工市場日漸飽和，產值日益下降，以柑橘果酒為代表的柑橘深加工產業受到越來越多的關注，并在發酵工藝[4-7]、酵母篩選[8-9]、脫苦[10-11]、澄清和陳釀技術[12-14]等方面取得了較大的研究進展。柑橘香氣是柑橘果酒區別于其它種類果酒的重要香氣屬性之一，是決定柑橘果酒品質、市場價值和消費者接受度的重要因素[15-16]。然而，迄今為止對于柑橘香氣在柑橘果酒釀造過程中的形成及影響機制少有報道?；诖?，本研究以柑橘汁為試驗材料，以柑橘香氣及其貢獻化合物以及異味物質為研究對象，通過研究橘汁發酵過程中柑橘香氣及其貢獻化合物和異味物質的變化，探討柑橘酒釀造過程中柑橘香氣形成過程及可能的影響因素，為今后該果酒香氣品質提升提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 柑橘樣品

城固蜜橘，采自陜西省城固縣橘園，采收時間為2021 年11 月5 日。果汁可溶性固形物含量12.5%，總酸含量0.58 g/100 mL，固酸比16.4，還原糖2.76 g/100 mL，出汁率36.4%。

1.2 材料及試劑

發酵袋、純凈水，市售；果酒酵母，安琪股份有限公司；聚酰胺樹脂、苯乙烯/二乙烯苯樹脂、果膠酶、表1 中序號為1～10 和18～25 的化合物、表4中的異丁酸、丁酸、2-甲基丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸，上海安譜實驗科技股份有限公司；表1 中序號為11～17 和26～29 的化合物，北京百靈威科技有限公司；二氯甲烷、乙醚、正戊烷、皂土、硫酸、飽和食鹽水、氫氧化鈉、無水硫酸鈉、蔗糖、偏重亞硫酸鉀和檸檬酸，國藥集團化學試劑有限公司。

表1 鮮橘汁呈香物質鑒定結果Table 1 Identification of aroma compounds in fresh orange juice

1.3 儀器與設備

榨汁機，廣東志高空調有限公司；LYT-330 型手持糖度計，昆山宏達光學儀器廠；固相萃取裝置，青島聚創環保集團有限公司；PHS-3C 型pH計，上海雷磁儀廠，CJJ78-1 型磁力攪拌器，常州市中貝儀器有限公司；TDL-5C 型臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；SHA-2A 型恒溫水浴鍋，常州市萬合儀器制造有限公司；正向硅膠色譜小柱，上海安譜實驗科技股份有限公司；2010plus-TQ8040 氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS）、2010plus-OPV277氣相色譜-人工嗅辨儀（GC-O），日本島津。

1.4 試驗方法

1.4.1 柑橘汁發酵 選取新鮮柑橘果實，清洗去皮后榨汁，向果汁中加入0.05%質量分數的果膠酶，40 ℃酶解60 min，加入蔗糖，調節糖度至25 Brix，加入偏重亞硫酸鉀調整SO2質量濃度至50 mg/L，加入檸檬酸，調節pH 值至4.0，接入活化酵母（10 倍質量分數2%蔗糖水中加入0.3%酵母，40℃溫育30 min），將果汁置于發酵袋中，于28 ℃連續發酵7 d。每天取樣1 次，共7 份樣品，保存于-20 ℃冰箱中，備用。

1.4.2 香氣物質提取 向100 mL 0.2%皂土溶液中加入10 g 柑橘汁樣品，攪拌混勻后室溫（25 ℃）靜置6 h，上清液加入聚酰胺樹脂，室溫攪拌過夜后，收集上清液并加入苯乙烯/二乙烯苯樹脂，室溫攪拌過夜后，收集樹脂并加入二氯甲烷，攪拌混勻1 h 后收集二氯甲烷，獲得橘汁香氣粗提物。香氣粗提物參考Joshi 等[17]報道的方法進行純化，最終獲得橘汁香氣基性組分、酸性組分、水溶性組分和中性組分。

1.4.3 香氣物質定性、定量分析 采用Chen 等[18]報道的方法，分析條件如下：色譜柱型號Inert-Cap-purWax（30 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm film thickness），離子源溫度250 ℃，傳輸線溫度230℃，進樣口溫度200 ℃，質譜掃描范圍m/z 40～400，掃描速率1 scan/s，載氣：氦氣（流量1 mL/min）。分離程序：起始溫度60 ℃，保持3 min，以3℃/min 速度升溫至220 ℃，保持10 min，進樣量1 μL，進樣方式不分流進樣。每個樣品分析3 次以上，取平均值。香氣物質定量分析采用內標法進行相對定量，內標物為癸酸乙酯（0.243 mg/kg），定性分析采用Nist2021 質譜庫檢索、標準品質譜比對結合保留指數法綜合分析，保留指數使用正構烷烴混標（C9～C27），采用公式（1）計算。

式中，RI——保留指數；RT（x）——待測化合物的保留時間（min）；n 和n+1——待測化合物流出前、后正構烷烴的碳原子數；RT（n）和RT（n +1）——待測化合物流出前、后正構烷烴的保留時間（min）。

1.4.4 柑橘汁關鍵呈香物質鑒定 采用Chen等[18]報道的氣味活性值（OAV）和GC-O 方法。分析條件如下：色譜柱型號InertCap-Wax（30 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm film thickness），進樣口溫度與分離程序如上所述，載氣：氮氣（流量1 mL/min），進樣量2 μL，進樣方法：不分流進樣，樣品在氣相色譜端和嗅聞端的分離比為1∶1，嗅聞口的溫度170 ℃，濕熱空氣流量為100 mL/min。嗅聞方法簡述如下：7 名來自陜西理工大學生物科學與工程學院食品質量與安全專業的本科生（年齡20～22 歲，3 名男性，4 名女性）組成感官評價小組成員，在GC-O 分析的整個運行時間內，每名成員對嗅聞口端的流出物進行嗅聞并記錄每個感知到的氣味物質的氣味特征和強度（強度范圍：1～5，其中“1”為弱，“5”為強），每個小組成員進行3 次嗅聞試驗，測得的香氣屬性的強度值為3 次嗅聞試驗的平均值并取整數。

1.4.5 感官分析 參考牛云蔚等[19]的方法，略有修改。20 mL 不同發酵階段橘汁樣品裝入棕色玻璃瓶中，上述7 名感官評價小組成員對樣品中的柑橘香氣強度進行描述和評分（強度范圍：0～5，其中“0”為無，“5”為強）。

1.4.6 數據處理 采用WPS Excel 2019 軟件對香氣物質相對含量進行統計分析，差異顯著性和相關性分析采用SPSS22.0 軟件。

2 結果與分析

2.1 柑橘香氣貢獻化合物鑒定

GC-MS 結合氣味活性值（OAV）和GC-O 分析結果顯示（表1），從鮮橘汁中共鑒定出29 種呈香物質，主要由果香氣（OAV平均值=206；氣味強度平均值=2.8）、柑橘香氣（OAV平均值=87；氣味強度平均值=2.9）、花香氣（OAV平均值=1 092；氣味強度平均值=2.5）、清香氣（OAV平均值=39；氣味強度平均值=3）和乳脂香氣（OAV平均值=2.5；氣味強度平均值=2）化合物構成。OAV 分析結果顯示，2-甲基丁酸乙酯（果香氣）和芳樟醇展示了較高的OAV 值，分別為1 000 和4 932，其次為檸檬烯（柑橘氣味）、己酸乙酯（菠蘿氣味）、辛醛（柑橘氣味）、α-松油醇（丁香氣味）、香茅醇（柑橘氣味）和丁香酚（丁香氣味），其OAV 值范圍在110～261 之間，其余呈香物質的OAV 值則較低。GC-O 分析結果顯示，2-甲基丁酸乙酯、辛醛和芳樟醇的氣味強度最高（5.0；強），其次為己醛、檸檬烯、香茅醇和丁香酚，其氣味強度值為4.0（較強）。此外，月桂烯、反式-2-已烯醛、己酸乙酯、癸醇、葉醇和α-松油醇也展示了中等的氣味強度（3.0）。相似的結果在前人的研究中也有報道，如Buettner 等[20]、Arena等[21]、Kumazawa 等[22]和Mastello 等[23]從鮮榨柑橘汁從中鑒定出己醛、月桂烯、檸檬烯、辛醛、壬醛、香蘭素等多種高OAV 氣味物質。

如圖1 所示，柑橘香氣是柑橘汁香氣結構中的重要香氣屬性之一，柑橘汁中類似柑橘氣味特征的香氣物質在柑橘香氣屬性形成中扮演重要角色[16，20]。在本研究中，柑橘汁香氣提取物經GC-O和OAV 分析共鑒定出月桂烯、庚醛、檸檬烯、γ-松油烯、癸醇、辛醛、辛醇、香茅醇和橙花醇等9 種柑橘香氣貢獻化合物。

圖1 基于GC-O 和香氣強度分析的柑橘汁香氣輪廓Fig.1 Aroma profile of orange juice based on GC-O and aroma intensity analysis

固相微萃取提取技術（SPME）因其操作簡便及萃取濃縮一步到位的優點，成為目前柑橘香氣物質提取最常使用的方法[4-9]，然而該方法由于受到萃取頭容量限制及纖維素膜選擇性吸附的影響，對香氣物質的吸附效率比較有限[15]。因而，本研究使用固相萃取技術[18]結合Joshi 等[17]的正向硅膠色譜分離方法對柑橘汁中的香氣物質進行高效萃取，將香氣物質分離為基性組分（I）、酸性組分（II）、水溶性組分（III）和中性組分（IV）。相較于傳統SPME 方法，該方法可大大降低香氣物質色譜分離過程中的峰重疊的出現，提高了定性準確性[24]。使用該方法，本研究從鮮橘汁中還鑒定出2-甲基丁酸乙酯、乙酸丁酯、異戊醇、乙酸芳樟酯、香茅醇和橙花醇等新的氣味物質，這些氣味物質在其它文獻中少有報道。

2.2 柑橘香氣及其貢獻化合物在橘汁發酵過程中的變化

對柑橘香氣在橘汁發酵過中的感官分析顯示，鮮橘汁在發酵1～4 d 的過程中，柑橘香氣強度呈逐漸增強的趨勢，隨后則逐漸減弱并呈現出濃烈的酸敗和刺激性氣味（表2）。相似的，伴隨柑橘香氣的增強，其貢獻化合物含量亦呈現顯著增加的趨勢，在發酵第4 天，含量平均增加了約2～15倍（表3），隨后則顯著下降。Pearson 相關性分析結果顯示，柑橘香氣強度的變化與檸檬烯、γ-松油烯、辛醇和橙花醇含量增減有顯著相關性（P＜0.05）。該結果表明，上述香氣物質在柑橘香氣形成中扮演了重要角色，是柑橘香氣的關鍵貢獻化合物。相似的變化趨勢在康明麗等[4]的研究中也有報道，該研究結果顯示，柑橘汁在發酵7～35 d 的過程中，包括檸檬烯在內的多種香氣物質的含量也呈現先增加后減少的趨勢。游離態和糖苷鍵合態是柑橘汁中香氣物質存在的兩種主要狀態，游離態香氣物質可被直接感知，而糖苷鍵合態香氣物質則無氣味[26-27]。柑橘汁在發酵初期香氣物質含量顯著增加，可能與柑橘汁發酵過程中，糖苷鍵合態香氣物質在酸或糖苷酶的水解作用下，形成游離態芳香化合物，從而使發酵橘汁中的香氣物質含量不斷增加有關[28]。

表2 柑橘香氣在橘汁發酵過程中的變化Table 2 Changes of orange characteristic aroma during orange juice fermentation

表3 柑橘香氣貢獻化合物在橘汁發酵過程中的變化Table 3 Change of orange -like aroma compounds during orange juice fermentation

2.3 橘汁發酵過程中異味物質的產生和變化

感官分析顯示，橘汁發酵4 d 后，伴隨柑橘香氣減弱，酸敗和刺激性氣味呈現逐漸增強的趨勢（表2），這與橘汁發酵后期異味化合物大量產生有關。成分分析結果顯示，在橘汁發酵后期，一些異味化合物，如異丁酸（刺激性難聞氣味）、丁酸（刺激性難聞氣味）、2-甲基丁酸（刺激性氣味）、戊酸（汗臭和腐臭味）、己酸（汗液酸臭味）、庚酸（脂肪酸敗味）和辛酸（酸敗和汗臭氣味）的含量呈顯著增加的趨勢（表4），這些異味物質對果酒中柑橘香氣具有顯著的遮蓋作用[29-31]。

表4 橘汁發酵過程中異味化合物的變化Table 4 Change of off-odorants during orange juice fermentation

3 結論

采用GC-MS 結合氣味活性值（OAV）和GCO 方法從鮮橘汁中鑒定出29 種香氣物質，主要由果香氣、柑橘香氣、花香氣、清香氣和乳脂香氣化合物構成，其中月桂烯、庚醛、檸檬烯、γ-松油烯、癸醇、辛醛、辛醇、香茅醇和橙花醇等化合物被鑒定為柑橘香氣貢獻化合物。在柑橘汁發酵過程中，柑橘香氣強度及其貢獻化合物含量均呈先增加后降低的趨勢，二者呈正相關，糖苷鍵合香氣化合物在橘汁發酵過程中，水解為自由態香氣化合物可能是柑橘香氣貢獻化合物顯著增加的重要原因。伴隨柑橘香氣強度及其貢獻化合物含量的降低，異味化合物含量則呈顯著增加的趨勢，其對柑橘香氣具有顯著的遮蓋作用。