酶催化固碳過程及其強化技術研究進展

王玉杰，張艷梅，欒金義，趙之平

（1 中石化（北京）化工研究院有限公司，北京 100013；2 北京理工大學化學與化工學院，北京 102488）

工業的快速發展和化石燃料的大量使用，導致CO2等溫室氣體的大量排放，引發諸多環境問題[1-2]。為此，開發高效、經濟的CO2捕集、利用及儲存（CCUS）技術減少CO2排放，實現CO2資源化利用非常重要[3-4]。在低碳排放的背景下，人們已提出了多種固定CO2（簡稱固碳）的策略，將CO2從大氣中捕獲并儲存或將其轉化為其他化合物，包括：物理固碳（吸附、冷凝）、化學固碳（化學吸附、礦物碳化）和生物固碳[5]。其中，使用化學或物理化學技術均存在成本高、效率低、能耗大、工藝復雜、環境污染等問題[6]。

天然生物固碳是生物質（如草木、微藻等）吸收自然環境中CO2或微生物利用CO2、CO和有機碳等為底物，通過酶催化轉化成有機物的過程。目前已發現的六種天然生物固碳途徑有：卡爾文循環、還原性三羧酸循環、還原性乙酰輔酶A途徑（W-L循環）、3-羥基丙酸/4-羥基丁酸途徑、3-羥基丙酸途徑、二羧酸/4-羥基丁酸途徑[7-8]。然而，天然生物固碳途徑，其核心氧化還原酶等存在催化速度慢、催化反應復雜、嚴格厭氧等諸多問題。因此，構建人工生物酶催化系統并對其進行優化，為酶催化固碳提供了新的機遇。相較于天然生物固碳，可以在生物體外人工構建生物固碳體系，利用生物催化劑酶，將工業過程中產生的CO2轉化為有機化合物及高價值生物基產品，該體系可以通過優化生物酶催化劑構建、反應器設計以及操作參數等，來提高酶的活性、貯存穩定性、固碳反應速率和效率，節能降耗，從而降低成本，實現過程強化。Tong等[9]報道了一種將CO2和乙醇通過相對簡單的多酶級聯催化途徑轉化為L-乳酸，在間歇式反應體系中可將41%乙醇轉化為L-乳酸，為生物可降解聚合物的合成提供新的、可持續的替代方法。天津大學姜忠義團隊[10]采用海藻酸鹽-二氧化硅復合材料將三種脫氫酶封裝固定，與游離酶相比，酶的活性、貯存穩定性和重復利用率顯著提高，CH3OH產率可達98.1%，貯存60 天及重復使用10 次以上均可保留超過76%的甲醇產率。在全球變暖和氣候變化日益嚴重的情況下，酶催化固碳被認為是一種可持續發展的解決方案，對生物體外酶催化固碳過程及強化技術研究具有重要意義。

本文介紹了用于酶催化固碳的關鍵酶類型及其優化。闡述了CO2資源化利用具體方式，包括催化CO2轉化為甲酸（HCOOH）、甲醇（CH3OH）、甲烷（CH4）、淀粉、L-乳酸、丙酮酸等。重點闡述了輔因子的原位再生、酶的固定化、反應系統的優化設計、反應條件優化（pH、溫度、底物濃度）以及產物原位分離等酶催化CO2反應過程的強化技術。最后，總結了酶催化固碳過程及強化技術研究存在的問題，并對其未來發展進行了展望。

1 催化CO2轉化酶及其優化

1.1 酶的分類

酶作為生物催化的關鍵，因其在高產率條件下執行復雜反應以生產所需的化合物而備受關注[11]?？蓪⒗肅O2作為底物的六種不同酶區分為兩類：①氧化還原酶[如甲酸脫氫酶（FDH）、一氧化碳脫氫酶（CODH）、重塑固氮酶等]和②裂解酶[碳酸酐酶（CA）、丙酮酸羧化激酶等][5,12-13]。通過使用自然界的不同酶進行CO2的體外催化轉化以合成化合物/燃料的情況列于表1中。

表1 不同酶催化CO2轉化

從理論上講，氧化還原酶是催化電子從一個分子（還原劑或電子供體）轉移到另一個分子（氧化劑或電子受體）的酶。在氧化還原反應中，使用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）等輔因子。氧化還原酶轉化CO2的目的是通過降低碳元素的氧化狀態來獲得碳基能源[14-15]。

1.2 酶的篩選和優化

盡管目前已經有大量的酶用于CO2催化轉化領域，但仍不能有效滿足環境應用與工業化生產中的迫切需求。在工業化生產中，酶需要在溶劑中發揮催化作用，酶的穩定性往往會受到很大影響，這一工業需求隨之帶來一個問題：能否利用蛋白質工程技術提升酶在溶劑中的穩定性，從而保證甚至提高其催化活性？

因此，為了充分發揮酶在CO2催化轉化中的作用，首要任務是對酶進行篩選與優化，選擇適合的酶催化劑，深入研究酶的優化策略，通過基因工程、蛋白質工程等方法對酶進行改造，提高酶的催化活性、穩定性和特異性，增強與CO2的結合能力?；诖?，在20 世紀90年代早期，美國加州理工學院Frances H.Arnold 教授開創了“定向進化”方法，即通過一定程度上模擬自然進化與選擇的過程，實現對蛋白質引入有益突變，從而改造蛋白質功能，并因其在“酶定向進化”上所作出的杰出貢獻被授予2018 年諾貝爾化學獎。受此啟發，為了緩解惡劣工藝條件對碳酸酐酶（CA）活性的抑制，Oscar 等[28]利用定向進化結合蛋白質序列活性關系（ProSAR）算法，通過10輪的突變與篩選，創制了一種高度穩定的CA 變體，這種CA 變體在pH>10的4.2mol/L 堿性胺溶劑中，耐受溫度高達107℃。相較于天然酶，該CA 變體的耐熱性和耐堿性顯著提高。Fisher 等[29]也利用蛋白質工程技術改性人碳酸酐酶（human carbonic anhydrase Ⅱ，HCAⅡ）中遠離活性位點的表面氨基酸殘基，存在于表面的部分氨基酸殘基（Tyr7、Leu224、Leu100、Leu240、Asn67 和Asn62）分別被苯丙氨酸（Phe）、絲氨酸（Ser）、組氨酸（His）、脯氨酸（Pro）、谷氨酰胺（Gln）和亮氨酸（Leu）取代，使疏水性氨基酸突變成親水性氨基酸，熱穩定性提高6℃。此外，FDH是各種CO2還原制甲酸系統中最好的生物催化劑之一，為了進一步提高FDH 的熱穩定性，Rojkova 等[30]采用了一種基于蛋白質α-螺旋疏水化的通用方法，對不同來源的9個FDH氨基酸序列進行比較研究，并結合來源于甲基營養細菌假單胞菌sp.101酶的三元結構分析，篩選出5個位點為131、160、168、184 和228 的 絲 氨 酸 殘 基（serine residues）進行誘變，Ser131 和Ser160 的殘基被替換為丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）和Leu，Ser168、Ser184 和Ser228 的殘基被改變為Ala，只有在131、160、184 和228 位置的Ser/Ala 突變導致了FDH 穩定性的增加。根據被取代殘基的位置，在131、160、184和228位置分別使用Ala取代Ser后得到的四種單點突變體（Ser131Ala、Ser160Ala、Ser184 Ala、Ser228Ala）可使FDH 穩定性提高5%～24%，而在131、160、184 和228 位置同時使用Ala 取代Ser 后得到的四點突變體（Ser131Ala/Ser160Ala/Ser184Ala/Ser228Ala）可使FDH的熱穩定性較野生型FDH提高1.5倍。

2 CO2的酶催化轉化

隨著生物催化領域的迅速發展，對于酶類催化系統的深入研究已經揭示出許多令人振奮的發現。酶作為高度選擇性和高效催化活性的生物催化劑，具有特定的催化基團和催化機制，其多樣性在催化轉化過程中充分展現。在了解酶的分類及其優化的基礎上，探討催化生物酶在CO2轉化領域中的應用。

2.1 碳酸酐酶催化CO2水合

CA 也被稱為碳酸鹽脫水酶或碳酸鹽裂合酶，其活性中心通常含有鋅離子（Zn2+），通過協助底物的吸附、促進水的裂解等催化水合CO2與水相互轉化[31-33]。根據結構和功能的不同，碳酸酐酶主要劃分為α、β、γ、δ四大類，其中的α-CA和β-CA是最為廣泛研究的兩類，存在于細菌、植物、動物等生物體中。

在自然狀態下，CO2的可逆水合反應十分緩慢，然而在CA 催化下，CO2水合反應速率常數顯著提高，這說明借助CA 能有效提高CO2的水合反應速率。催化機理為兩個關鍵步驟：第一步是CA中與活性中心Zn2+相連的H2O去質子化形成中間產物EZnOH-，隨后CO2與EZnOH-中的OH-水合形成EZnHCO-3，然后EZnHCO-3中的HCO-3被水置換形成EZnH2O 和HCO-3[式(1)]；第二步是EZnH2O 的去質子化，EZnH2O 通過酶分子中的質子轉運體將質子（H+）轉運至溶劑中并被還原成具有催化活性的EZnOH-，在催化過程中主要是通過酶分子活性區域64號組氨酸（His64）實現H+向溶劑轉運[式(2)，其中B表示質子受體]。

2001 年，受HCA Ⅱ快速水合作用的啟發，Bond 等[34]首次報道了牛碳酸酐酶（bovine carbonic anhydrase Ⅱ，BCAⅡ）對CO2的捕獲和轉化效果。為接下來幾十年內研究人員從生物體內提取CA 并捕獲CO2提供了重大機遇。Supuran 等[35]研究指出CA 活性中心的Zn2+通過與CO2的Lewis 酸-堿反應，與CO2形成穩定配合物實現高效吸附。這一步驟被認為是整個催化反應的起始點，隨后活性中心中的Zn2+發揮催化作用，降低H2O分子裂解的活化能[36]，促使H2O 分子發生裂解，產生H+、OH-?；诖?，Silverman 等[37]進行了大量的動力學研究，建立了CA 催化CO2水合反應的機理模型，揭示了其催化機制的關鍵步驟。結果表明，CA 催化CO2水合反應中基本且關鍵步驟是H2O的水解作用[38]。

2.2 CO2轉化為甲醇

CH3OH 作為一種重要的化學品，具有廣泛的用途和經濟價值[20]。不僅是清潔燃料的關鍵組成部分，也是合成許多有機化合物的基礎原料，酶催化CO2還原策略為甲醇的可持續生產提供了有效的解決方案[39-40]。

為了提升CH3OH 的轉化效率，近年來多酶級聯催化CO2轉化為甲醇受到了廣泛關注。其中，在輔因子NADH 的作用下，FDH、甲醛脫氫酶（FaldDH）以及乙醇脫氫酶（ADH）共同參與催化CO2生成CH3OH的反應模式成為備受矚目的研究前沿之一。相對于以單一酶為基礎的燃料（如CO、CH4等）生產方法，采用多酶法生產液態CH3OH具備更高的能量容量，并且便于儲運[41-42]。Yoneyama等[43]首次以FDH 和甲醇脫氫酶（MDH）為催化劑，吡咯喹啉醌（PQQ）為輔因子，成功地將CO2電化學還原為甲醇。如Yoneyama 的報告所述輔因子的類型極大地影響了CO2的還原行為，適當的輔因子可以提高多酶反應的速率。為了利用脫氫酶在輔因子存在下有效催化CO2還原這一事實，Wang等[44]驗證了該多酶級聯反應體系的熱力學可行性；孟令玎等[15]將三種脫氫酶共同封裝在多孔硅膠溶膠-凝膠基質中，發現與游離酶相比，甲醇產率/產量顯著提高，這歸因于多酶在硅膠納米孔內的限域封裝提高了其催化活性，有利于反應的熱力學平衡。

2.3 甲酸脫氫酶催化CO2產甲酸

FDH 催化CO2轉化的首選產物應為HCOOH 或CO[式(3)、式(4)]，其中，HCOOH 可用于CH3OH 生產、H2生產、直接HCOOH燃料電池等領域，是一種重要的化學品。FDH 通?？煞譃閮煞N類型：①金屬依賴型FDH，其活性部位含有鉬（Mo）或鎢（W）的金屬依賴酶，Mo 或W 原子構成氧化還原活性中心；②非金屬依賴型FDH，其依賴于輔因子NADH（NADPH）進行CO2還原[45]，大量案例表明[29]，在溫和的反應條件下，以NADH為電子供體，FDH 可催化CO2反應生成HCOO-[46-49]。同時，FDH 也可催化CO2甲酸化逆反應，將HCOOH 氧化為CO2，伴隨著NAD＋還原為NADH，因此控制逆反應的發生對FDH催化CO2甲酸化十分重要。

以往的研究表明，在酶促CO2還原HCOO-的過程中，FDH 所需的NADH 量較大，為規避NADH的高成本和獲取困難造成的限制，研究人員提出多種解決方案。包括電/光驅動的NADH 再生，旨在降低成本并改善甲酸鹽的產量。例如，將NADH直接分散在帶有中性紅（neutral red，NR）修飾電極的陰極室中，通過酶電催化實現CO2還原成HCOO-[48]。此外，通過合成金屬有機框架（MOF）封裝FDH 酶，可以利用可見光或紫外光照射來驅動NADH的再生以及CO2的減排。2023年，加拿大滑鐵盧大學陳忠偉與河南師范大學楊林團隊[3]通過利用生物電催化技術在體外環境下促進生物酶的活性，將FDH 原位封裝在以Zn為配位金屬、2-甲基咪唑為配體制備得到的沸石咪唑骨架結構材料（ZIF-8）中，該框架充當輔酶并增強酶的混合協同催化作用。研究表明，合成的FDH@ZIF-8 納米籠結構雜化（CSH）催化劑表現出改進的酶催化能力，CSH 催化劑使CO2轉化為HCOOH 的速率比純FDH催化劑高28倍。

2.4 固氮酶還原CO2制備甲烷

CH4是清潔能源和化工工業的重要原料之一，通過固氮酶（nitrogenase）將CO2轉化為CH4，對實現低碳經濟和促進化工領域的發展至關重要[7,50]。固氮酶是介導生物固氮過程的一類特殊酶，根據其活性中心和催化機制的不同，主要被分為鐵-鉬氮酶（FeMo固氮酶）和鐵-鐵氮酶（FeFe固氮酶）[30]。固氮酶催化中心位于固氮酶的FeMo 輔因子，在三磷酸腺苷（ATP）參與下，經多次電子/質子轉移反應，催化N2生成兩分子NH3[式(5)]。

近年來，Zheng 等[51-52]首次研究發現了沼澤紅假單胞菌內的純鐵固氮酶不僅可以固定N2為NH3，也可以固定CO2產CH4。這為探索CO2甲烷化新方法提供了思路。隨后，Yang等[53]發現鉬鐵固氮酶雖然不能還原CO2，但是，當鉬鐵固氮酶活性中心附近的兩個關鍵氨基酸被替換后，可催化CO2發生八電子或雙電子轉移，以低速率催化還原為CO 或CH4[式(6)、式(7)]，為利用固氮酶人工轉化CO2提供新的思路[54]。與此同時，生物電化學電-氣（powerto-gas，P2G）系統利用生物電化學P2G 技術，通過微生物酶催化將CO2轉化為CH4，對環境清潔友好，引起廣泛關注。P2G 系統包括兩個階段過程[式(8)]：①通過水電解產生氫氣；②將CO2在生物體內轉化為CH4[55-56]。

2019 年，福建農林大學Zhou 等[57]首次證明了CO2還原為CH4可以通過產甲烷菌-半導體生物雜化體來完成。巴氏甲烷八疊球菌（Methanosarcina barkeri）被選為高效代謝CO2轉化為CH4的產甲烷菌。將硫化鎘（CdS）納米顆粒與M.barkeri混合作為捕光聚合物，構建了M.barkeri-CdS生物雜化體。作為光敏劑的CdS具有高吸收系數的量子點，其表面靜電作用可以支持與產甲烷菌的連接以減少電荷轉移障礙。該雜化體的CH4產生速率為0.19μmol/h、量子效率為0.34%。該研究結果對通過探索新型納米光導體與微生物之間的相互作用來開發用于CO2轉化的半人工光合作用具有重要意義。美國加州大學Yang等[26]利用CdS納米顆粒、金納米團簇、高表面積硅納米線陣列、MOF 等，實現了非光合作用細菌利用W-L途徑將CO2還原為乙酸的反應，并使用甲烷菌作為固定CO2的生物催化劑，通過光電催化方法，實現CO2到CH4的轉化。

2.5 CO2到淀粉的人工合成

淀粉作為一種關鍵的多糖類化合物，在生活和經濟中扮演著重要的角色。它不僅是植物中主要的能量儲存形式，也是人類飲食結構的基石，廣泛應用于食品、醫藥、造紙和生物燃料等領域[58]。然而，當前社會面臨著日益嚴峻的氣候變化和資源匱乏的挑戰，迫切需要尋求更加環保、可持續的生產方式。近年來，酶催化CO2人工合成淀粉的研究備受關注，將CO2引入反應體系，不僅能促進轉化過程，還可以將其固定，減緩其對環境的負面影響。同時，將酶催化技術與CO2轉化相結合，旨在開發一種環保高效的淀粉合成方法，為淀粉的綠色生產提供有力支持[59]。

2021 年，中國科學院天津工業生物技術研究所馬延和團隊[60]聚焦于綠色工業制造，在國際上首次不依賴光合作用實現CO2人工合成淀粉，為建立CO2人工生物轉化技術體系提供了新思路。該團隊采用一種類似“搭積木”的方式，通過化學-生物催化混合策略，在一個無細胞體系中利用CO2和H2合成淀粉。該合成途徑（ASAP）由11個核心反應組成，通過路徑設計，經過模塊化組裝以及對三個瓶頸酶進行蛋白工程優化而建立。經過核磁共振檢測，發現人工合成淀粉分子的結構與天然淀粉分子一致。初步實驗表明，相較于傳統農業生產淀粉，人工合成淀粉的生產效率提升了8.5 倍。在充足的能量供給條件下，根據目前的技術參數，一個立方米大小的生物反應器理論上年產淀粉量相當于我國5畝玉米地的年產淀粉量。這條新路線使淀粉生產方式從傳統的農業種植向工業制造轉變成為可能，為CO2合成復雜分子開辟了新的技術路線。

2.6 CO2轉化為其他化學品

在CO2酶催化轉化領域，除了已經受到廣泛關注的甲醇、甲烷、甲酸和淀粉等化學原料與產品外，還有其他具有潛力的資源化利用途徑，例如：L-乳酸、丙酮酸等。L-乳酸作為一種重要的有機酸，在醫藥、食品、聚乳酸等領域具有廣泛的應用前景。Miyazaki 等[61]以乙醛和CO2為原料，采用丙酮酸脫羧酶逆反應和乳酸脫氫酶催化丙酮酸加氫相結合的方法，一鍋兩步酶促合成L-乳酸。同樣地，該團隊也以乙醛和CO2為原料，利用啤酒酵母丙酮酸脫羧酶和焦磷酸硫胺（輔因子）的協同作用，成功催化CO2的羧基化反應，合成丙酮酸[62]。2009年，美國洛杉磯加利福尼亞大學Liao等[63]通過基因工程技術改造了Synechococcus elongatusPCC7942 菌株，使其能夠直接利用CO2產生異丁醛和異丁醇，并通過表達1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）來提高產物的產量。CO2與脂肪族化合物羧基化反應、菌株的基因改造不僅實現對CO2的高效利用，也為構建綠色、低碳的化工產業鏈提供了新的可能性。

3 酶催化CO2轉化的過程強化

要充分發揮酶在CO2催化轉化中的作用，不僅需要深入了解其應用領域，還需要理解影響其催化效率的關鍵因素，這涉及到諸多復雜的生物催化機制和反應條件優化。根據酶催化固碳過程的本質特征，目前研究報道的該過程的強化技術可歸納為：輔因子的原位再生、酶的固定化、反應條件（pH、溫度、底物濃度）優化、反應系統的優化設計以及產物原位脫出分離等。

3.1 輔因子的原位再生

研究表明，將輔因子與酶進行共價結合可以提高酶活性，因此如何高效原位再生輔因子，持續驅動酶催化反應性，降低反應成本，也是酶催化CO2轉化反應體系中亟須解決的問題。在調整反應體系中底物排列、優化物質傳遞的基礎上高效原位再生輔因子是提高催化效果的重要舉措，中國科學院過程工程研究所Wang 等[64]將CO2級聯還原制甲醇多酶集成系統原位封裝在聚電解質摻雜的中空納米纖維管腔中，在管腔側引入谷氨酸脫氫酶（GDH），通過將各組分進行精確空間排列及區域劃分實現NADH的連續再生。結果表明，酶促NADH再生的甲醇產率可達95.3%，無酶促NADH再生時，甲醇產率僅為33.1%。此外，將酶與NADH再生系統整合為一體，以提高局部NADH濃度、促進酶催化反應，這也是優化體系的一大策略。中國科學院天津工業生物技術研究所Zhu 等[65]構建了CO2電還原系統，依賴輔因子NADH 的FDH 催化CO2還原成甲酸，并結合電沉積的銅納米顆粒（CuNPs）催化NADH 再生。此外，沉積在碳氈（CF）電極上的CuNPs 還可以通過CuNPs 與FDH 表面的半胱氨酸殘基（Cys）之間形成Cu—S 鍵，作為固定化FDH的載體。同時為了增加FDH 附近的輔因子濃度，通過聚乙二醇（PEG）交聯形成FDH-NAD+共軛物，縮短了再生NADH 在FDH 和CuNPs 的催化位點之間的移動距離，進而提高局部NADH濃度，促進整體反應，提高CO2的還原速率。當NADH濃度從1mmol/L 增加至4mmol/L 時，甲酸產量增加，與1mmol/L NADH 相比，最佳3mmol/L NADH 的甲酸產量增加約70%。

3.2 酶固定化

在酶法固碳的捕集和轉化過程中，游離酶在實際操作環境或極端條件（如高溫、強酸強堿或有機溶劑等）下，酶分子容易失活，且不易回收和重復利用，使得酶的工業化應用受到了很大限制。固定化酶技術是指利用載體將酶束縛或限制在一定的區域內，仍能保持酶特有的催化活性的一類技術，該技術可有效克服游離酶的局限性[7,66]。通過選擇良好的載體和合適的固定化方法對游離酶進行固定，是提高酶的催化活性、降低催化劑成本、提高穩定性和再利用性的有效途徑[67]。

3.2.1 固定化方法

酶固定化是通過物理或化學方法將游離酶與特定的載體材料結合。所構建固定化酶體系的催化效率和穩定性在很大程度上取決于載體的選擇以及固定化方法的應用。首要考慮的是在固定化過程中保持酶的活性。按照酶與載體的結合方式，主要分為吸附、共價結合、包埋法、交聯法以及近年來發展起來的原位合成法五大類，固定化方法的具體策略與優缺點如表2所示。

表2 固定化方法優缺點

3.2.2 固定化酶的載體

固定化酶的載體[74]主要可歸納為高分子材料、無機材料以及聚合物-無機復合材料。經靜電紡絲制備的聚合物纖維具有顯著的比表面積[75]，從而可有效增加酶的固載能力。Jun 等[16]成功報道了一種高負載且穩定的BCA，以酶沉淀涂層（EPC）的形式，由酶共價連接固定在電紡聚合物納米纖維上。沉淀和交聯組成的EPC 即使在室溫下于水溶液中以200r/min 搖動孵育868 天后仍能保持65.3%的初始活性。無機載體主要有氧化硅[76]和氧化鈦納米粒子[77]、磷酸鹽納米花等。Ali 等[78]通過使用3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES） 對磁性納米粒子（MNP）表面的氧化硅涂層進行氨基改性，之后將CA 固定在氨基改性的氧化硅涂層表面，重點研究了不同溫度（30℃、40℃、50℃）分別對游離酶與固定化酶的活性影響。在不同溫度下孵育80min后，固定化酶分別保留89%、93%、35%的初始酶活，而游離酶分別保留79%、56%、24%；該固定化酶在連續使用13 個周期后保留了61%的初始活性。Rasouli等[79]提出一種新型的混合酶促工藝：將HCAⅡ酶固定在填料表面，同時將MNP 分散在生物反應器的液體吸收劑中。通過聚多巴胺/聚乙烯亞胺（PDA/PEI）共沉積實現填料和MNP表面的胺官能化處理，使HCAⅡ能夠通過戊二醛固定在改性表面上。即使經過40 天，固定在填料和MNP 上的HCAⅡ仍保持80%和84.7%的初始活性。MOF因具有結構可修飾、孔道可調節、框架可設計等優點，是催化CO2轉化酶的優良載體[80]，其中相較于其他MOF 系列，UiO-66-NH2具有更大的比表面積和發達的微孔結構，有利于酶的負載與固定；另一方面，其孔徑（0.38～0.55nm）更接近CO2的動力學分子直徑（0.35～0.51nm），從而增加CO2的吸附熱，同時其極性官能團氨基的存在，可進一步提高對CO2的吸附，這對實現CO2的高效轉化至關重要。2022 年，河北工業大學Jiang 等[81]將微孔UiO-66-NH2轉化為具有微孔和中孔的多層次多孔結構（HP-UiO-66-NH2），旨在通過優化孔隙結構促進FDH 的固定和CO2富集，CO2富集和電催化NADH再生相結合，提高了酶電催化體系的CO2還原能力，優化后的催化體系3h 內甲酸濃度為1.826mmol/L（是自由酶體系的5.57 倍）。2018 年，天津科技大學的Jia 等[82]成功將CA 通過物理吸附固定在ZIF-8上，固定效率超過95%，同時保持了固定化酶活性的75%。經過9次循環利用后，固定化酶的保留活性約為85%。酶固定后，其構象發生一定程度的變化，從而提升了酶對高溫和表面活性劑的耐受性。

3.3 反應系統的優化設計

酶催化CO2轉化的過程中，反應器的選擇也是一個至關重要的環節。不同類型的反應器在傳質特性、溫度控制等方面呈現出顯著的差異，直接影響到催化效率和產物選擇性。因此，為了最大程度地發揮酶的催化功能，必須深入了解各類反應器的特性及其在酶催化轉化中的適用性，研究反應系統的流體力學和傳質性能，強化相間傳質。

3.3.1 傳統酶反應器

不同的反應器設計，如鼓泡式反應器（BCR）、流化床式反應器（FBR）、填料床反應器（PBR）等都可以實現酶促CO2生物轉化。Iliuta等[83]在填充床反應器內，將游離的HCAⅡ固定在填料表面上并使微粒分散在液相中來增強CO2的水合過程。Chook 等[84]在研究反應器類型對酶生物催化反應的影響時，提出傳統反應器通常采用機械攪拌器，通過機械攪拌產生液體的剪切來改善流體的混合，從而提高酶生物催化劑與其他反應物的接觸面積。然而，強烈攪拌產生的高剪切作用力會破壞酶固定化系統，影響酶的催化活性。劉曉軍等[85]圍繞連續流酶反應器展開研究，并提出在化工生產中，連續流工藝相較于分批工藝具有固有的優勢，包括質量和傳熱的改善、催化反應的顯著優化、長時間穩定高效的運行。

雖然傳統酶反應器已經得到廣泛應用，但是仍有酶的利用率低、產物不能及時分離等不足。酶膜反應器（EMR）將生物催化、產物的分離、濃縮及酶的回收等操作步驟結合成一個操作單元，能實現連續生產、不同操作單元的集成，具有顯著優勢，是近年來反應器研究中的一個重要領域。

3.3.2 酶膜反應器

EMR 的設計需要考慮酶的使用形式與位置，酶既可以以游離的形式使用，也可以以固定的形式來設計EMR。膜的位置也是有所不同，如直接在反應器的底部或位于反應器的外部。1994 年，Prazeres和Cabral[86]基于酶和底物的接觸機制將酶膜反應器分為直接接觸式酶膜反應器、擴散接觸式酶膜反應器、界面接觸式酶膜反應器。2022 年，Sitanggang 等[87]指出Prazeres 和Cabral 基于酶和底物的接觸機制進行酶膜反應器分類的工作是首篇關于EMR 的評述文章，并根據膜功能、流體動力學，將EMR 分為死端EMR （dead-end EMR）、錯流EMR （cross-flow EMR）、界 面EMR （interfacial EMR）、滲析EMR（dialysis EMR），如圖1 所示。相對于死端EMR、錯流EMR 和滲析EMR，界面EMR 因其固定化酶的穩定性以及結合了膜技術與酶催化的優勢而備受關注，在酶催化CO2轉化過程中具有廣闊的應用前景。

圖1 游離酶和固定化酶膜反應器示意圖[87]

氣液膜反應器作為界面EMR 的一種形式，將液體吸收的高選擇性、酶催化與膜分離相結合[88]。在氣液膜反應器中，首先將固定化酶在液相懸浮，在CO2通氣進入溶液的過程中，要求CO2在固定化酶懸浮的溶液界面鼓泡，確保CO2在溶液中擴散到酶的路徑最小化，CO2濃度梯度和傳質速率最大化[89]。2017年，澳大利亞新南威爾士大學Chen等[90]受脂質細胞膜Janus 兩側親水-疏水特性的啟發，提出Janus CO2氣液膜反應器高效水合和轉化策略。納米級間隔CA 和FDH 被定位在明確的聚丙烯（PP）多孔膜中氣-液界面處，具有較高的底物濃度。通過這項工作，證實酶的納米級聯空間布置對于有效反應至關重要。2021 年，該團隊[73]同樣將CA和FDH原位固定在PDA/PEI改性的PP平板膜上構建多酶級聯反應體系，隨后通過PDA 中的鄰苯二酚基團與金屬離子發生螯合作用，以啟動晶體原位生長合成ZIF-8薄膜，以還原CO2為HCOOH，在氣液膜接觸器中催化后的HCOOH 產率為22%，除平板膜以外，界面EMR 常用的膜結構還包括管狀和中空纖維膜（HFMs）[87]。

相較于傳統鼓泡式反應器中的單噴嘴、多孔板式氣體分布器，中空纖維膜以中空微孔膜材料為“芯片”，通過微納米尺度孔道將氣相反應物分散成大量微氣泡，是實現物質快速混合和高效傳質的重要手段[91-92]。2016年，北京理工大學Zhao 等[93]從反應器設計優化與成本控制出發，首次將疏水聚合物HFMs 作為氣體分布器和改性聚乙烯（PE）HFMs作為固定化酶的載體組合在同一模塊中，以FDH為催化劑，NADH 為輔因子，構建了HFMs 反應器用于CO2轉化為HCOOH。CO2通過疏水HFMs 的膜孔進行曝氣（模式1，圖2）。研究表明氣體分布器HFMs 的孔隙率和表面疏水性等參數對反應有很大影響，當最佳孔隙率約為50%時，聚合物膜水接觸角越大，產生的微氣泡尺寸越小，反應速度越快。在該團隊以往的研究中，共價結合固定FDH制備得到的FDH-PE中空纖維膜反應器采用不同的CO2通氣方式[94]，具體為：FDH-PE 短膜絲置于反應溶液中，將CO2以內壓方式鼓泡通過一根PE 中空纖維膜絲，該膜絲一端連接氣體管道，另一端在反應溶液中開放并在溶液中鼓泡（模式2），該模式的CO2濃度在進口處最大，然后沿膜絲長度方向單調減小，這導致了反應器入口處反應速率最高、選擇性卻較小，從而影響總產率。與直接通氣模式2相比，模式1中CO2注入到HFMs管腔中被高比表面積的微孔HFMs分散成大量的微氣泡，氣-液-固相間接觸充分，相間面積增加，氣含率增大，CO2在溶液中的擴散和溶解過程增強。另一方面，大量的可移動微氣泡體系在反應器中軸向、徑向的運動，引起強烈的擾動，有效增加了液相的湍動，強化了氣液兩相流的傳質特性，顯著提高了相間傳質效率，促進CO2向甲酸鹽的轉化。Trachtenberg等[95]設計了一種HFMs反應器來捕集燃燒后煙道氣中的CO2。Iliuta 等[96]采用動力學模型在中空纖維膜生物反應器（HFMB）中探索固定化HCAⅡ催化CO2吸收過程。因此，HFM模塊被用作酶催化CO2轉化過程中的氣體分布器和反應器，可以圍繞氣液兩相流中微氣泡形成及調控、氣液兩相流的傳質特性等，強化氣-液-固多相催化反應過程，其必將成為實現化工過程高效、節能的重要組成。

3.4 反應條件優化

酶作為生物催化劑促進CO2催化轉化過程涉及多個反應條件，通過調節反應條件，例如溫度、pH、底物濃度等，以最大限度地提高酶催化CO2的效率和產率?？筛鶕唧w的酶和反應系統，通過實驗優化反應條件，獲得更佳的催化效果。

3.4.1 pH

酶催化反應體系的pH 直接影響酶的構象和活性。研究表明，酶催化過程對pH 極為敏感，需要適宜pH[50]。磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（PCK）是植物基礎代謝途徑的主要酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）草酰酸的反應[27]。產丁二酸放線桿菌以秸稈糖為碳源固定CO2過程中，PCK是其轉化關鍵酶，該關鍵酶對環境pH變化較敏感，當pH為6.5～7.0 時酶活性較高。因此在發酵過程中應及時添加中和劑，否則生成過量丁二酸會造成發酵液pH 過低，進一步抑制酶活性影響發酵[97]。2012年，中國科學院蘭州化學物理研究所華紹烽等[98]采用共沉淀法制備磁性殼聚糖微球作為載體固定FDH，并在30oC 時，測定酶在pH=2～10 的緩沖液中的活力。隨著pH 的增加，相對酶活力先升高后降低；游離酶最適宜反應pH=7，由于微環境表面電荷性能的影響，固定化酶的最適宜反應pH=6，向酸性方向偏移。FDH 經過固定后，在堿性和酸性溶液中穩定性均有明顯提高且固定化酶的pH適應范圍擴大。在強酸（pH=2）和強堿（pH=10）條件下，固定化酶的相對酶活分別為11.03%和38.43%，然而游離酶已全部失活。這是由于磁性殼聚糖微球的物理吸附和共價交聯作用，使蛋白質構象發生變化，對酶的結構起保護作用，使其不容易被破壞。2019年，美國西北大學Farha 等[99]將FDH 封裝在鋯基MOF（NU-1006）中，FDH@NU-1006 活性不受pH 降低的影響，說明NU-1006在酸性環境下對FDH具有保護作用。這是因為NU-1006 的孔徑（6.2nm）與FDH 的動力學直徑（6nm×4nm×11nm）幾乎一致，可促進FDH 和MOF 內部之間的范德華相互作用，進而通過避免酶的脫落使其免于失活，耐酸性明顯增強。酶的活性與其特定的三維結構密切相關，而pH 會改變溶液中的氫離子濃度，從而影響蛋白質的電荷狀態，這種電荷狀態的改變會引起酶蛋白質結構的變化，進而影響其催化活性[12]。

3.4.2 溫度

溫度直接影響酶的催化速率和穩定性。酶的活性與其分子振動狀態密切相關，而溫度的升高會增加分子的振動程度，從而提高酶催化反應速率，然而，過高的溫度也容易導致酶的失活。近年來，由酶生物礦化誘導結晶的MOF，熱穩定性強，可作為酶周圍的保護層提高其在高溫下的穩定性。Chai等[73]將CA和FDH原位包埋在以PP或陶瓷為基材制備的ZIF-8 涂層中，用于CO2氣液膜接觸器，經過4h 反應，HCOOH 產率達到22%。在100℃沸水中孵育1h 后，ZIF-8 中的CA@FDH 活性基本保持穩定，而游離酶的活性則完全喪失。在150℃空氣中暴露1h 后，活性從55%降至45%，經過7 次循環后保持在60%左右。2018年，鄭州大學Zhang等[100]基于CA 穩定性差的局限性，利用CA 的金屬活性位點，將CA 和金屬磷酸鹽自組裝合成雜化納米花（M-CANF，M 代表Mn2+、Ca2+、Cu2+）。研究表明M-CANF 具有良好的生物催化活性和穩定性，MCANF在30oC下，沒有任何活性損失，在50oC下均保持60%以上的生物活性，特別是Ca-CANF 可重復使用性和熱穩定性顯著提高。

3.4.3 CO2底物濃度

在酶催化反應中，底物CO2濃度直接影響催化反應的速率和產物產量，因此在催化反應中，提高催化體系中CO2底物濃度非常關鍵，主要體現為三方面：CO2壓力、氣體流量、通入方式。2020 年，天津大學Ma 等[101]利用高速攝像機研究多通道微反應器中CO2在甘氨酸鈉水溶液中的氣液分布和傳質特性，提出CO2的吸收效率隨氣體流量的增加先增大后減小。同樣地，也有研究人員提出在少量酶負載條件下，氣體流量是影響CO2吸收的主要因素[102]。在北京理工大學Zhao等[94]的研究中，探討了兩種不同的CO2通入方式，即加壓和膜絲鼓泡，對中空纖維膜固定化FDH 催化CO2合成甲酸的影響。比較結果顯示，采用鼓泡法的情況下，在反應進行9h后，反應收率達到了2.39%，而加壓法的反應收率僅為0.36%。鼓泡法明顯促進了CO2在水中的溶解和擴散過程，有利于CO2的轉化。此外，隨著鼓泡裝置孔徑的減小，CO2在水中的溶解傳質系數也相應增大[103]。同樣地，該團隊在CA 促進CO2轉化為HCOOH 過程中，優化反應條件[40]，其中CO2壓力從0.2MPa 增加到0.5MPa 時，反應速率由(1.20±0.09)×10-3mol/min 增 加 到(2.17±0.07)×10-3mol/min，當壓力進一步增加到1.0MPa 時，反應速率變化不大。CO2壓力對反應的影響主要體現在兩個方面：溶液中底物濃度和反應壓力。一方面，由于反應平衡不利，較高的壓力絕對有利于HCOOH 的生成[104]；另一方面，CO2壓力越高，CO2在反應溶液中的溶解度越高。

3.5 產物原位分離

產物原位分離（in situproduct separation，ISPS）是將分離單元與生物催化反應系統直接結合的混合生物過程，主要目的是通過產物分離，以改變熱力學不利的反應體系的表觀平衡[105]。同時，ISPS 可以有效地減少產物的抑制作用、避免副反應，進而提高產率。

酶催化芳香酸的脫羧反應及逆向的芳香烴羧基化反應（即科爾貝-施密特反應）在常壓水相體系中進行，可以解決傳統科爾貝-施密特反應需要劇烈反應條件的難題。但是，在常壓水相體系中反應的熱力學平衡使得反應的轉化率很低，即使在最優條件下仍低于50%。2015 年，中國科學院天津工業生物技術研究所生物催化與綠色化工研究團隊[106]用含有芳香酸脫羧酶的重組大腸桿菌作為生物催化劑，在體系中添加沉淀劑季銨鹽，羧基化產物會形成銨鹽，銨鹽會不斷沉淀，將間苯二酚和鄰苯二酚的反應平衡向羧化方向推動，解決了可逆平衡反應轉化率低的問題，使對間苯二酚和鄰苯二酚的羧化轉化率可達97%。首次實現了酚類化合物的酶促羧化反應，為二氧化碳綠色固定及有機芳香酸的綠色合成提供了新途徑。Ohde等[107]以CO2作為碳源，在根瘤菌中的2,6-二羥基苯甲酸脫羧酶（2,6-DHBD）將間苯二酚羧化成2,6-二羥基苯甲酸（2,6-DHBA）的過程中，利用三乙醇胺（TEA）獲得較高的CO2底物濃度，并添加溴化四丁基銨（TBA-Br）用于使產物2,6-DHBA 原位沉淀，提高平衡轉化率和反應速率。研究表明，在0.14mol/L TEA、350mmol/L TBA-Br 和80mmol/L 間苯二酚進行羧化反應時，平衡產率提高了36.8%。

依賴于疏水性樹脂的吸附與離子交換也是常用的減少產物抑制的途徑。Larachi 等[108]研究在Robinson-Mahone 反應器中固定化HCAⅡ對CO2的催化水合作用。為了增加CO2的水合動力學，提高催化水合效果，介紹了兩種去除液相中HCO-3的方法。第一種策略為通過氯化鈣使其原位沉淀生成CaCO3，然而其轉化率并沒有提高，可能是由于酶埋藏在CaCO3沉淀物下；另一種方法是用37～74μm 或200～400 目的球形離子交換樹脂吸附HCO-3，CO2轉化率提高兩倍，效果顯著。然而，這種過程強化策略可能難以在裝載填料的大型填料床中實施。因此，Iliuta 和Larachi 等[109]提出了一種多尺度（通道-酶涂層-樹脂）模型，研究在固定HCAⅡ的三相（氣-液-固）整體式漿態反應器中催化CO2水合及離子交換原位去除HCO-3。離子交換原位去除HCO-3是通過漿液型離子交換樹脂（強堿型陰離子交換樹脂，IRN-150）吸引負電荷離子，從而減少產物抑制。當樹脂濃度為10kg/m3，CA濃度從2mg/L增加到12mg/L時，CO2的轉化率增加了30%。

4 結語與展望

CO2的高效利用已成為國內外研究的熱點和前沿。構建生物體外酶催化固碳體系，實現CO2向能源物質，如CO、甲烷、甲醇及其他重要化學品的轉化，將成為降低大氣中CO2濃度的有效途徑之一。本文一方面介紹用于酶催化CO2生物資源化利用的關鍵酶及其優化，并闡述了其典型應用，尤其是CH4、CH3OH、HCOOH、淀粉等高附加值化學品。另一方面，聚焦于酶催化固碳的過程強化技術，主要有輔因子的原位再生、酶的固定化、反應系統的優化設計、反應條件優化（pH、溫度、底物濃度）以及產物原位分離等對酶催化性能的影響，強化生物催化反應過程，實現CO2的高效固定與資源化利用。綜上所述，從實驗室到工業生產，酶催化與工業碳排放結合的過程中，關鍵步驟為CO2的高效溶解和傳質過程的優化。首先引入有機胺等利用其化學親和性實現液相中CO2富集，并結合微氣泡技術、加壓等調控氣液兩相流的傳質特性，強化氣-液-固多相催化反應過程，同時在反應過程中，采用產物原位分離技術，提升多相催化反應中CO2的轉化率。酶催化固碳體系的構建有效提升碳捕集效率，為降低碳排放做出實質性的貢獻。

現階段，以工業應用為目標的生物催化固碳領域的主要發展瓶頸為:①開發高穩定性和低成本的酶催化劑；需揭示載體材料、結構及其制備條件等對酶反應特性等方面的影響規律，解析酶催化和載體構建過程中的協同調控機制，為高性能工業生物催化提供理論指導；②建立催化過程中關鍵參數對催化轉化產物的調控機制；需揭示各參數單獨調控機制及相互影響規律；建立過程的動力學模型，優化條件，實現CO2的高效轉化?；诿复呋墓烫技夹g仍需不斷改進和創新，在未來的研究中，酶催化CO2轉化制備乙二醇、L-乳酸、二羥基丙酮、丙烯酸等化學品是值得重點關注的方向；并且，應集中于光-酶、電-酶、新型納米催化劑以及它們的協同催化[110]，實現結構的耦合和性能的提升，是酶催化CO2轉化領域的發展趨勢，以實現能源物質及有用化學品的可控制備。