番茄Ph-2 基因晚疫病株齡抗性的比較轉錄組分析

潘春陽，李鑫，蘇文悅，胡俊玲，魯曉曉，潘峰，張晨，張輝，黃澤軍，國艷梅，王孝宣，杜永臣，劉磊，李君明

（中國農業科學院蔬菜花卉研究所，蔬菜生物育種全國重點實驗室，北京 100081）

卵菌綱致病疫霉（Phytophthorainfestans）引起的晚疫病是危害番茄生產的毀滅性病害，其生理小種進化快、致病力強、化學防治難有成效，培育抗性品種是實現晚疫病防治的有效措施（Foolad et al.，2008；Li et al.，2011）。

目前，抗番茄晚疫病最有效的基因是Ph-2與Ph-3，聚合二者可抗多個生理小種，在抗性品種培育中應用最為廣泛（Zhi et al.，2021）。但研究表明Ph-2和Ph-3基因均存在株齡相關抗性（age-related resistance，ARR），轉入Ph-2和Ph-3基因的抗病材料三葉期幼苗接種致病疫霉后表現為一定程度的感病，其抗性隨著株齡增加而逐漸增強，并在六葉期后充分表達（Chungwongse et al.，2002；李君明等，2007；李濤 等，2015）。

株齡相關抗性通常指植物的某種抗性隨苗齡增長而出現增強或降低的現象，是植物對病毒、細菌、真菌、卵菌、昆蟲等抗性適應性的一種普遍現象（Hu & Yang，2019），在合適的株齡，植物激活更強的免疫反應，既可以增加對病原的抗性，又能減少其他時期不必要的免疫激活而造成的負面影響，但這同時意味著在株齡更小時期，抗性品種幼苗仍然面臨著病原侵染的威脅。前人研究發現許多開花植物的植株抗病性與其株齡正相關，并通過對擬南芥、蘋果、草莓和黃瓜等轉錄組分析，發現這種抗性可能是由物理屏障、化學防御和先天免疫等協同組成，并涉及多個信號轉導通路的調控（Gusberti et al.，2013；Ando et al.，2015；Mansfeld et al.，2017；Zou et al.，2018；Hu & Yang，2019）。盡管目前對株齡相關抗性機制已經有了初步認識，但尚未有在轉錄組水平上對番茄-晚疫病互作中株齡相關抗性分析的報道。

本研究通過對Ph-2晚疫病抗性材料三葉期與六葉期幼苗接種后不同時期的轉錄組分析，對可能調控其株齡抗性的基因進行了初步篩選，并對水楊酸與乙烯信號轉導通路響應晚疫病抗性的差異表達基因進行了分析，以期為揭示番茄晚疫病株齡抗性相關機制提供理論依據，為培育晚疫病持久抗性番茄品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用Ph-2晚疫病抗性材料是以Heinz1706為背景的近等基因系，由中國農業科學院蔬菜花卉研究所番茄遺傳育種課題組構建，2020 年5 月分批播種，第1 批播種后10 d 進行第2 批播種，幼苗定植于本所北圃場溫室，待第1 批播種幼苗第6片真葉充分展開，第2 批播種幼苗第3 片真葉充分展開、第4 片真葉剛剛長出時，選取長勢相近、一致性好的幼苗進行接種鑒定。致病疫霉T0，1生理小種由本所植保室提供。

1.2 接種鑒定

參照李濤等（2015）的接種鑒定方法，對Ph-2晚疫病抗性材料三葉期與六葉期幼苗各20 株進行接種鑒定。

1.3 樣品RNA 的提取、建庫測序與分析

接種后0、8、24、48 h 分別取三葉期幼苗第3 片真葉，六葉期幼苗第6 片真葉，使用華越洋Quick Total RNA Isolation Kit 提取試劑盒提取RNA，每個樣品設置2 次生物學重復，建庫測序與分析由北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.4 qRT-PCR 驗證

對轉錄組測序結果與篩選到的差異表達基因進行qRT-PCR 驗證，使用諾唯贊HiScriptⅡ 1 st Strand cDNA Synthesis Kit 進行測序RNA 樣品的反轉錄。采用 SYBR?Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa，USA）進行qRT-PCR 反應，以番茄Actin基因作為內參基因，每個反應設3 次重復，使用2-ΔΔCT方法分析結果。

1.5 數據分析

利用Microsoft Excel 2016 軟件整理試驗數據，使用SPSS 24 軟件進行差異顯著性分析，使用GraphPad Prism 8 對統計數據進行作圖。

2 結果與分析

2.1 番茄Ph-2 基因不同株齡的晚疫病抗性鑒定

番茄晚疫病病原菌接種后表型鑒定的時間一般為7 d 左右，本試驗所用的病原菌生理小種致病力較弱，因此接種后8 d 進行表型鑒定，結果如表1 所示，Ph-2抗性材料三葉期幼苗病級指數5.30 ±0.66，六葉期幼苗病級指數2.30 ± 0.94，存在極顯著性差異（P＜0.01），表明Ph-2基因存在株齡相關抗性。

表1 番茄Ph-2 晚疫病抗性材料三葉期與六葉期幼苗接種后表型鑒定結果

2.2 番茄Ph-2 基因不同株齡晚疫病抗性的轉錄組測序

對三葉期幼苗與六葉期幼苗接種后0、8、24、48 h 4 個時間點共計16 個樣品進行轉錄組測序，共獲得98.12 Gb Clean Data。各樣品的Clean Data Q30 堿基百分比均不小于92.38%。分別將各樣品的Clean reads 與番茄Heinz1706 參考基因組進行序列比對，各樣品的reads 比對效率在87.79%～97.07%之間，各重復間相關性均高于0.8，以上結果表明轉錄組測序數據可用于下一步分析。

2.3 番茄Ph-2 基因晚疫病株齡相關抗性基因的篩選

由圖1 可知，對0 hpi（hpi 為接種后時間，單位：小時）與48 hpi 三葉期幼苗與六葉期幼苗差異表達基因進行KEGG 富集分析，均能富集到“植物-病原互作”中的相關基因，表明在病原侵染前與侵染完成后，三葉期幼苗與六葉期幼苗抗性存在一定差異。

圖1 三葉期幼苗與六葉期幼苗在接種后0 h（A）和48 h（B）差異表達基因KEGG 富集分析

為了探究Ph-2晚疫病抗性材料出現株齡相關抗性是否為Ph-2基因在不同株齡幼苗中差異表達所致，對不同株齡材料在4 個取樣時間點的差異表達基因進行了篩選（Fold change ≥2，FDR ≤0.01，表達量單位：FPKM）。分析發現（表2），Ph-2基因精細定位區間中所有基因在兩組材料中均不存在表達差異，因此推斷Ph-2株齡相關抗性并非由Ph-2基因在不同材料中差異表達引起。進一步分析發現，在差異表達的基因中也不包括NBS-LRR、STK等其他典型抗病基因，降低差異表達基因篩選標準（Fold change ≥1.5，FDR ≤0.05）后仍得到相同的結果。因此，推斷本試驗中Ph-2抗性材料出現株齡相關抗性并不是由抗病基因差異表達直接導致。

表2 不同樣品組間差異表達基因情況

進一步對三葉期幼苗和六葉期幼苗在0～48 hpi 與8～48 hpi 間均存在差異表達的基因進行分析（表3），在0～48 hpi 間篩選到1 個在六葉期幼苗中表達量始終顯著高于三葉期幼苗基因Solyc01g006290，該基因編碼過氧化物酶活性蛋白，可進行細胞氧化解毒，并參與調控木質素合成。木質素是細胞壁修飾的重要組成部分，在植物抗病性中起著重要作用（Passardi et al.，2010）。同時過氧化物酶活性基因在植物細胞壁受到破壞時還可以作為信號物質激活下游免疫反應，如疫霉侵染辣椒后，辣椒過氧化物酶活性基因的表達與植株抗性正相關（Alcázar et al.，2010）。在8～48 hpi 間的差異表達基因中同樣篩到六葉期幼苗表達量顯著高于三葉期幼苗的過氧化物酶活性基因Solyc02g087110。此外，還篩選到3 個未知蛋白，其表達量在六葉期幼苗與三葉期幼苗中存在顯著性差異。如圖2 所示，試驗進一步通過qRT-PCR 驗證了轉錄組的分析結果。

圖2 株齡抗性相關基因在不同時期幼苗中的表達量

表3 株齡抗性相關基因的篩選 單位：FPKM

由于過氧化物酶活性基因在植物細胞壁建成與修復中起關鍵作用，因此進一步篩選了六葉期幼苗較之三葉期幼苗差異表達基因中與細胞壁相關的基因。結果在0、8、24 hpi 和48 hpi 中分別篩選到178 個（125 個表達量顯著上調，53 個顯著下調）、120 個（45 個顯著上調，75 個顯著下調）、9 個（5個顯著上調，4 個顯著下調）、225 個（171 個顯著上調，54 個顯著下調）與細胞壁相關的差異表達基因，其中六葉期幼苗表達量顯著高于三葉期幼苗的基因大多與細胞壁的生物發生和修飾有關，少數表達量低于三葉期幼苗的基因與細胞壁分解等相關。

2.4 番茄Ph-2 基因不同株齡水楊酸與乙烯信號轉導通路中免疫響應基因的分析

水楊酸與乙烯信號轉導通路中相關基因介導了番茄對晚疫病的抗性反應（Eschen-Lippold et al.，2010）。通過對接種后水楊酸與乙烯信號轉導通路差異表達基因分析（Fold change ≥2，FDR ≤0.01，表達量單位：FPKM）表明，三葉期與六葉期幼苗接種后水楊酸信號轉導通路中17 個基因差異顯著，其中多數基因表達趨勢在2 種材料中較為一致，而Solyc01g106620、Solyc09g006005、Solyc09g007010、Solyc11g068370和SLnewgene3379共5 個基因在三葉期幼苗中表達量明顯高于六葉期幼苗（表4）；乙烯信號轉導通路中9 個基因差異顯著，其中6 個基因在2 種材料中的表達模式與表達量較為相近，Solyc09g089930、Solyc07g008250、Solyc01g009170共3 個基因在兩種材料間表達趨勢不一致且表達量差異較大（表5），這可能與乙烯信號轉導途徑中復雜的反饋調節機制相關。

表4 水楊酸信號轉導途徑中差異表達基因單位：FPKM

表5 乙烯信號轉導途徑中差異表達基因 單位：FPKM

3 結論與討論

株齡相關抗性是植物中普遍存在的一種防御機制，它在一定程度上協調了生長發育與抗性反應之間的平衡，揭示株齡相關抗性機制是實現作物持久抗性的關鍵，也是作物育種的重要目標。本試驗發現，2 個過氧化物酶活性基因Solyc01g006290和Solyc02g087110在不同株齡番茄幼苗葉片中的表達差異可能是番茄抗晚疫病Ph-2基因株齡相關抗性產生的原因之一。

過氧化物酶活性基因在植物抗病中發揮重要作用。辣椒中CaPO2的異源表達可增強擬南芥的抗病性，引起HR 反應、H2O2積累和病原體相關（PR）基因的表達（Choi，2007）。水稻中OsPrx114的異源表達也能夠誘導PR 基因的表達并增強對病原體的抗性（Wally & Pnuja，2010）。研究表明，在病原菌侵染初期，過氧化物酶基因的表達與抗性正相關，抗性物種在這一時期會迅速反應并產生大量的過氧化物酶，感病物種則出現反應滯后或不產生過氧化物酶的情況（蔣選利 等，2001），這與本試驗中過氧化物酶基因Solyc02g087110的表達類似，其0 hpi的表達量在六葉期幼苗與三葉期幼苗中不存在顯著性差異，在8 hpi 時受到病原侵染表達量均出現一定的下調，但六葉期幼苗中該基因下調幅度較小且表達水平顯著高于三葉期幼苗，而后其表達量迅速恢復并持續高水平表達，但在三葉期幼苗中，該基因的下調幅度明顯更大，并在8～48 hpi 間持續低水平表達。另外，細胞壁相關過氧化物酶在植株受到外傷、病原等外部作用后能夠催化木質素或木栓素等物理屏障的形成，實現細胞壁硬化，從而限制病原物的入侵（Passardi et al.，2010）。本試驗中篩選到的另一個過氧化物酶基因Solyc01g006290位于木質素合成通路，正調控木質素合成。其在三葉期幼苗與六葉期幼苗中的表達差異可能影響受損細胞壁的修復效率與硬化程度，造成細胞壁強度差異，進而導致株齡相關抗性的產生。通過對六葉期幼苗與三葉期幼苗差異表達基因中細胞壁相關基因的分析結果也與此推斷基本一致。

此外，前人研究表明水楊酸與乙烯介導的信號轉導通路在番茄晚疫病抗性中起重要作用（李濤等，2015），本試驗對接種致病疫霉后水楊酸與乙烯信號轉導通路相關基因的表達量進行了分析，發現六葉期幼苗與三葉期幼苗中相關基因的表達趨勢基本一致，但部分基因的表達模式與表達量存在較大差異，這些差異可能在一定程度上影響到抗性激活的時間與強度。

本試驗結果表明，植物株齡相關抗性可能不是由典型抗病基因在不同株齡植株中差異表達直接引起的，其可能是由過氧化物酶活性基因、細胞壁修復與強化、激素信號轉導等先天免疫組分在不同株齡材料中差異表達導致。但株齡相關抗性是由內在的復雜網絡調控，其表達模式涉及環境條件、植物生理狀態和病原體周期之間復雜的相互作用，并由物理屏障、化學免疫和先天防御協同組成，株齡抗性的互作不僅限于基因與基因間，在基因與miRNA 間也存在復雜的相互作用（Shubin &Dahn，2004；Zhang et al.，2011；Ando et al.，2015；Mansfeld et al.，2017；Luan et al.，2018；Zou et al.，2018）。因此，揭示株齡相關抗性機制需要借助多組學技術綜合分析，進而加快株齡抗性關鍵基因的鑒定，解析其時空表達特性，以期借助基因編輯等手段改變相關基因特定時期的表達模式或提前激活株齡相關抗性的“基因開關”，從而創制出具有持久抗性的新種質。