藏藥鼠麴草的質量評價研究

楊錫金，劉翔，王云紅，張小梅，舒抒，陽勇*，王計瑞**，鐘國躍

（1.重慶市中藥研究院 國家中醫藥管理局中藥化學三級實驗室／重慶市中藥資源學重點實驗室，重慶 400065；2.中國中醫科學院 中藥資源中心 重慶分中心，重慶 400065；3.遵義醫科大學 藥學院，貴州 遵義 563000）

鼠麴草為菊科（Asteraceae）植物鼠麴草（Gnaphalium affineD. Don）的干燥地上部分［1］，藏藥名“干得巴渣”或“甘達巴扎”，收載于《藏藥志》［2］、《中華本草（藏藥卷）》［3］、《中國藏藥》［4］、《西藏自治區藏藥材標準》（2012年）［1］等藏醫典籍及標準中。藏醫理論認為鼠麴草具有祛風濕、消痞瘤的功效，常用于治療“培根”病、痞瘤、痛風及風濕性關節炎等［1-2］。鼠麴草中主要含有黃酮類［5］、有機酸［6］、揮發油［7］及微量元素等［8］化學成分，其中黃酮類為主要活性成分［9-11］?，F代研究表明，鼠麴草具有抗氧化［9］、改善氣管炎［12］、保肝［13］及抗癌［14-15］等藥理作用。鼠麴草資源蘊藏量豐富，在全國各地廣泛分布，除了在藏區被藏醫用于臨床使用外，也被國內其他地區的地方標準所收載，作“鼠曲草”使用［16-19］。目前，漢藏地區各標準對鼠麴（曲）草的質量控制手段較簡單，尤其是藏區（僅有性狀、顯微和薄層鑒別）［1］，難以保障質量穩定，嚴重影響了臨床療效的和生產發展。因此，本實驗對鼠麴草進行水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物及含量測定等研究，結合化學計量學統計分析方法對其進行質量評價，以期為有效控制該藥材的質量和完善相關地方標準提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

23批鼠麴草收集于2021年8月至9月，樣品存放于重慶市中藥研究院資源中心。經重慶市中藥研究院劉翔研究員鑒定為菊科植物鼠麴草的干燥地上部分，具體信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

1.2 試劑與儀器

木犀草素（純度：98.52%，批號：MUST-21072311）和芹菜素（純度：98.03%，批號：MUST-22030615）均購于成都曼思特生物科技有限公司；甲醇（色譜純，批號：21045193，美國TEDIA），磷酸（色譜純，批號：20211129，天津市科密歐化學試劑有限公司），其余試劑均為分析純，購于重慶川東化工（集團）有限公司。

100 mm × 200 mm硅膠G薄層板（青島海洋化工有限公司）；100 mm × 200 mm薄層色譜展開缸（上海信誼儀器廠）；Waters e2695高效液相色譜儀、PDA檢測器（美國沃特世公司）；UV 2600紫外分光光度計（日本島津公司）；BS 224S 萬分之一、CPA225D十萬分之一電子天平（德國賽多利斯）；VGT-2013 QTD超聲波清洗器（廣東固特超聲股份有限公司）；HH-ZK6恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責任公司）；SX2-10-12Z智能一體式箱式電阻爐（上海博訊醫療生物儀器股份有限公司）；DHG-9146A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海龍躍儀器設備有限公司）；UPR-Ⅱ-20L純水儀（四川優普超純科技有限公司）。

1.3 TLC定性鑒別

1.3.1 對照品溶液制備

精密稱取木犀草素和芹菜素適量，加甲醇制成濃度為0.2 mg/mL的對照品溶液，即得。

1.3.2 供試品溶液制備

取供試品約0.5 g，精密稱定，加入15 mL甲醇，超聲處理15 min，濾過，濾液濃縮至1 mL，即得。

1.3.3 鑒別方法

按照2020年版《中國藥典》（以下簡稱“藥典”）四部通則0502薄層色譜法試驗，吸取對照品溶液1 μL、供試品溶液2 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷 ： 乙酸乙酯 ： 甲酸（8 ： 6 ： 1）為展開劑，展開，取出后晾干，噴以1%三氯化鋁試液，105℃加熱，于365 nm紫外光燈下檢視。

1.4 檢查與浸出物

根據2020年版《中國藥典》四部通則測定23批樣品水分（0832第二法）、總灰分及酸不溶性灰分（2302）和浸出物（2201）。

1.5 含有量測定

1.5.1 色譜條件

Welch Ultimate? AQ-C18色譜柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）。流動相：甲醇（A） - 0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0 ～ 45 min，47% A；45 ～ 47 min，47% ～ 90% A；47 ～ 55 min，90% A；55 ～ 57 min，90% ～ 47% A；57 ～ 65 min，47% A），流速1.0 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫30℃，進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品（A）和供試品（B）HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances（A） and test sample （B）

1.5.2 對照品溶液制備

精密稱取木犀草素和芹菜素對照品適量，加甲醇制成含木犀草素0.749 mg/mL和芹菜素0.391 mg/mL的混合對照品溶液。

1.5.3 供試品溶液制備

取供試品約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，用甲醇補足減失的重量，0.22 μm微孔濾膜濾過，取濾液，即得。

2 結果與分析

2.1 TLC定性鑒別結果

23批樣品的TLC鑒別結果見圖2。由圖可知，在供試品和對照品色譜相應位置上顯相同的熒光斑點，而且圖像清晰。

圖2 木犀草素和芹菜素TLC色譜圖Fig.2 TLC chromatograms of luteolin and apigenin

2.2 檢查與浸出物結果

23批樣品的檢查與浸出物結果見表2。結果表明高海拔地區與低海拔地區的樣品水分含有量分別在7.83% ～ 9.24%、8.25% ～ 10.70%之間，總灰分含有量分別在5.95% ～ 10.44%、9.04% ～ 17.11%之間，酸不溶性灰分含有量在0.83% ～ 4.39%、1.57% ～9.40%之間。浸出物含有量分別在22.03% ～27.43%、8.87% ～ 21.90%之間。

表2 水分、總灰分、酸不溶性灰分和浸出物含有量測定結果Tab.2 Results of content determination of water， total ash，acid-insoluble ash and extracts

2.3 含有量測定

2.3.1 線性關系考察

取“1.5.2”項下對照品溶液，用甲醇梯度稀釋，得到系列質量濃度的對照品溶液，過濾，在“1.5.1”項色譜條件下進樣測定。以質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）做標準曲線，得到木犀草素和芹菜素的回歸方程分別為Y= 31 282 680X-36 584（r= 0.999 9），Y= 26 449 515X- 35 086（r=0.999 4），在0.7 ～ 374.5 μg/mL和0.4 ～ 195.5 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.3.2 精密度試驗

取“1.5.2”項下對照品溶液在“1.5.1”項色譜條件下連續測定6次，測得木犀草素和芹菜素峰面積RSD分別為2.02%和2.45%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩定性試驗

精密稱取1份供試品（SQC-16），按“1.5.3”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12和24 h在“1.5.1”項色譜條件下進樣測定，測得木犀草素和芹菜素峰含有量RSD分別為1.16%和0.74%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.4 重復性試驗

精密稱取同一批藥材粉末（SQC-16）6份，按“1.5.3”項下方法制備供試品溶液，在“1.5.1”項色譜條件下進樣測定，測得木犀草素和芹菜素含有量RSD分別為2.72%和1.54%，表明該方法重復性良好。

2.3.5 加樣回收試驗

精密稱取含量已知的藥材（SQC-16）6份，加入適量對照品，按“1.5.3”項下方法制備供試品溶液，在“1.5.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表3。木犀草素和芹菜素的加樣回收率范圍分別在95.83% ～ 100.74%和93.48% ～ 102.04%之間，平均加樣回收率分別為98.95%（RSD = 1.94%）和97.18%（RSD = 3.46%），符合藥典規定。

表3 木犀草素和芹菜素加樣回收率試驗結果Tab.3 Results of recovery tests for luteolin and apigenin

2.3.6 樣品含有量測定

取23批藥材，按“1.5.3”項下方法制備供試品溶液，在“1.5.1”項色譜條件下進樣測定，計算含有量，結果見表4。結果表明，18批西藏地區和其他地區（3批市場和2批川西）收集的鼠麴草中木犀草素含有量分別為0.043 3% ～ 0.106 4%和0.026 2% ～0.063 3%，芹菜素的含有量分別為0.013 9% ～0.043 1%和0.015 6% ～ 0.047 4%；市場樣品（除SQC-21外）中木犀草素和芹菜素的含有量比西藏地區樣品的含有量低。

表4 木犀草素和芹菜素含有量測定結果Tab.4 Results of content determination of luteolin and apigenin

2.4 化學計量學方法分析

2.4.1 聚類分析

運用SPSS 20.0軟件，以平方歐氏距離作為度量標準，以水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、木犀草素和芹菜素含有量6個指標為變量，進行標準化后，對23批樣品進行系統聚類分析，共被分為4類，結果見圖3。結果表明，絕大多數藏區的樣品歸為第Ⅰ類，市場收集及川西地區的樣品分別分為Ⅱ類（SQC-21）、Ⅲ類（SQC-19、SQC-20和SQC-22）、Ⅳ類（SQC-23）。

圖3 23批樣品聚類樹狀圖Fig.3 Dendrogram of 23 batches of samples

2.4.2 主成分分析

以浸出物、木犀草素和芹菜素含有量3個指標作為變量，特征值和累計貢獻率作為判定依據，運用SPSS 20.0軟件對23批鼠麴草進行主成分分析。根據降維結果，共挑選出2個主成分PC1和PC2，特征值分別為2.066和0.656，各成分方差貢獻值分別為68.851%和21.873%，累積貢獻值達到90.724%，代表性強，可以用來評價鼠麴草的質量。由表5可知，PC1主要反映浸出物、木犀草素和芹菜素的含有量信息，PC2主要反映芹菜素的含有量信息。

表5 各成分因子載荷矩陣Tab.5 Factor load matrices of various constituents

根據各因子載荷矩陣及特征值計算得分系數，進一步得到PC1和PC2方程式分別為PC1 = 0.631 ZX1+ 0.584 ZX2+ 0.734 ZX3，PC2 = -0.091 ZX1-0.307 ZX2+ 0.464 ZX3，其中ZX1、ZX2和ZX3分別為浸出物含有量、木犀草素和芹菜素含量的標準化值；綜合得分Y= 0.688 PC1 + 0.219 PC2。利用上式計算各批鼠麴草質量綜合得分并按結果進行排序，見表6，得分越高，樣品的質量越優，排序越靠前。除SQC-1、SQC-2、SQC-4、SQC-6和SQC-13，絕大多數藏區樣品排名比較靠前，其中SQC-7、SQC-10、SQC-11、SQC-14和SQC-16質量較優（綜合得分大于0.9）；除SQC-21外，市場采購及川西地區的其他4批（SQC-19、SQC-20、SQC-22和SQC-23）排名在最后。主成分散點圖見圖4，西藏地區的樣品與川西地區及市場采購的樣品明顯被區分。其中，西藏地區樣品間差異較小，分布集中；川西地區及市場采購的樣品分布較為分散，樣品間差異性較大。主成分分析的結果與聚類分析整體一致。

圖4 主成分分析散點圖Fig.4 Scatter diagram of principal component analysis

表6 主成分得分及綜合得分結果Tab.6 Results of pricipal component score and overall score

3 討論

3.1 TLC

現行藏區標準中僅以鼠麴草對照藥材作為對照［1］，但目前中檢院系統中尚未有鼠麴草對照藥材售賣，尋找時存在較大難度。其他省市（低海拔地區）的地方標準中鼠曲草多選用槲皮素作對照品［18-19］。經課題組前期研究發現，西藏地區產鼠麴草中的槲皮素含量低，在TLC中鑒別特征不明顯，而木犀草素和芹菜素的含量則較高，也是藥材中的主要藥效成分。研究表明木犀草素能夠通過抑制NLRP3炎性小體來保護類風濕性關節炎大鼠的骨關節［20］，木犀草素和芹菜素具有治療痛風的作用［21-22］，這與鼠麴草“治療痛風及風濕性關節炎”的作用相一致，因此選擇這2種活性成分作為TLC的對照品。

另外，在按照現行藏區標準中展開系統［環己烷 ： 乙酸乙酯（8 ： 2）］展開時未能顯現出木犀草素和芹菜素的斑點特征。經過對展開系統的優化，最終選擇了圖譜清晰、專屬性強、重復性好、分離度高的環己烷 ： 乙酸乙酯 ： 甲酸（8 ： 6 ： 1）作為展開劑。同時，本研究進一步優化了供試品溶液的制備方法，分別考察了提取溶劑（甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯和丙酮）、提取時間（10、15和20 min）和料液比（1： 20、1： 30和1： 40）的影響，最終選用甲醇為溶劑，料液比為1 ： 30，超聲15 min作為制備TLC供試品溶液的最佳方法。此外，還考察了包括展開距離、不同來源薄層板、展開環境在內的方法耐用性。結果表明，該方法耐用性良好，可用于鼠麴草藥材中木犀草素和芹菜素的定性鑒別。

3.2 檢查項

本研究發現，不同來源的鼠麴草樣品中水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物的含有量均有較大差異。西藏地區的18批樣品檢查項指標比較穩定，水分均 ＜ 10.0%，總灰分均 ＜ 10.5%，酸不溶性灰分均 ＜ 4.5%，浸出物均 ＞ 22.0%；而其他地區5批樣品的檢查項指標則差異明顯。值得注意的是，絕大多數鼠麴草樣品的總灰分含有量均較大，平均值高達9.02%，推測這可能是由于原植物地上部分密被絨毛，花序蓬松，容易藏納風沙中的沙土所致。其中，SQC-19、SQC-20和SQC-22中不僅總灰分含有量極高，其酸不溶性灰分（去掉植物生理性灰分的部分）也異常高，從側面證實了上述推測。

浸出物是反應藥材質量的重要指標［23］，而現行藏區標準中尚未規定鼠麴草浸出物的限度。因此本研究以浸出物的出膏率和總黃酮含有量作為指標，分別考察了冷浸法、熱浸法以及7種提取溶劑（無水乙醇、80%乙醇、60%乙醇、稀乙醇、40%乙醇、20%乙醇和純水）對鼠麴草浸出物的影響，結果發現以稀乙醇作提取溶劑采用熱浸法提取時，浸出物含有量和總黃酮含量均高于其他組。

3.3 含量測定

黃酮類成分為鼠麴草的主要活性成分［9-11］，現行各地方標準中均未有含量測定項［1，16-19］。因此，本研究建立了同時測定鼠麴草中木犀草素和芹菜素的HPLC含量測定方法，該方法簡單、穩定，可作為評價鼠麴草質量的重要手段。經過對色譜條件的優化，將有效檢測時間控制在45 min以內的等度洗脫（其他時間為沖柱和平衡）；同時，對包括提取溶劑（無水乙醇、甲醇、80%甲醇和60%甲醇）、提取方式（回流和超聲）、提取時間（15、30和60 min）及料液比（1： 30、1 ： 50和1 ： 100）等因素在內的供試品溶液的制備進行優化。最終確定了“1.5.3”項下供試品溶液制備方法。此外，鼠麴草樣品富含絨毛，粉碎后絨毛成棉絮狀，與其他粉末分離，不易混勻，取樣量過少時難以均勻取樣。在進行加樣回收率試驗時，稱樣量減半后為0.25 g，測定結果不穩定，加樣回收率偏差較大；若將稱樣量設為1.0 g時，供試品溶液中的其他干擾峰數量及峰高會增多（圖2B），增加了洗脫難度且易使硅膠柱過載，降低分離效果，因此在建立含量測定方法時將稱樣量定為0.5 g。而在加樣回收率試驗時為了減小取樣造成的不均因素，將稱樣量也設為0.5 g，按含有量 ： 加入量（2： 1）添加對照品。

3.4 質量評價

本研究采用聚類分析和主成分分析法對不同產地鼠麴草藥材的質量進行評價。結果表明，西藏地區鼠麴草樣品分布集中、質量均一、樣品間差異較小，而市場購買及川西地區的鼠麴草樣品（SQC-19、SQC-20、SQC-22和SQC-23）間的質量差異性較大，綜合得分排名靠后，質量較差。雖然西藏地區和其他地區的鼠麴草樣品基源相同，但其質量卻有較大差異。此外，在國內其他地區（尤其是低海拔地區）的標準中，以“鼠曲草”之名收錄的藥材，雖然其基源與西藏地區相同，但由于受到海拔、氣候和環境等因素的影響，在植物形態（植株大小、直立或匍匐等）和化學成分含量上均存在一定差異。因此，在制定西藏自治區地方標準時建議對樣品的采集范圍或者產地進行限定，以保證藥材的質量。

值得注意的是，川西地區的2批（SQC-22和SQC-23）樣品在地理和氣候上與西藏地區相近，但藥材質量卻也表現出明顯差異，限于樣本量較少，僅2批藥材難以判斷出是個體差異還是共性問題，在后續的研究中也將繼續補充該地區的樣品做進一步研究。由于藏醫和中醫指導理論的不同，西藏地區收載的“鼠麴草”與其他地區收載的“鼠曲草”在功效與主治上也有諸多差異。在后續的研究中，可結合藥效學分別對藏醫和中醫體系下的該藥物進行深入的對比研究。

4 結論

本研究對鼠麴草的TLC定性鑒別、檢查項及HPLC含量測定進行較為系統及全面的研究，為該藥材的質量控制提供了有效的科學手段，同時也為相關地方標準的完善提供了參考依據。