人參皂苷Rg1 通過抑制NLRP3 炎癥小體途徑減輕氧糖剝奪/復供后小膠質細胞炎癥反應

王興航， 丁佳媛， 李放， 包翠芬*， 閻麗菁*

錦州醫科大學 1.組織胚胎學教研室，2.人體解剖學教研室，3.分析化學教研室，4.基礎醫學實驗教學中心，遼寧 錦州 121001

缺血性腦卒中（Ischemic stroke，IS）是臨床上最常見的一種卒中類型，占所有卒中患者的80%以上，具有高發病率、高死亡率、高致殘率、高復發率四個特點，且常急性起病，嚴重威脅人類健康和生命[1]。目前，臨床上常采用溶栓治療IS，但若血栓自溶或溶栓藥物使用超過時間窗，血流再通后可引起腦缺血再灌注 損 傷（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）[2]。CIRI 是一個動態變化的病理生理過程，包括能量代謝障礙、氧化損傷、炎性細胞浸潤、血腦屏障破壞、細胞內鈣超載、細胞自噬、凋亡等，其中炎性反應是其主要病理過程之一[3]。小膠質細胞是腦內常駐免疫細胞，在受到內源性或外源性刺激后迅速激活，釋放抗炎因子，促進組織修復與重塑。但是在發揮抗炎作用的同時也釋放大量的促炎因子及神經毒性介質，加重缺血部位組織損傷[4]。因此，減輕炎癥，積極控制小膠質細胞過度激活是減輕腦缺血再灌注損傷的重要環節之一。研究發現核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（Nucleotide-binding oligomerization domainlike receptor protein3，NLRP3）炎癥小體與炎癥的發展密切相關，大量實驗已經證實炎癥反應通常伴隨NLRP3 炎癥小體表達增多，因此，抑制NLRP3 炎癥小體表達對控制炎癥發展具有重要意義[5]。人參皂苷Rg1 是人參的主要生物活性成分，具有廣泛的藥理活性，例如抗炎癥反應、抗纖維化、抗自由基損傷、抗疲勞及顯著的神經保護和肝保護的作用，還可促進干細胞的增殖和分化。前期實驗已證實Rg1 可減輕腦缺血再灌注損傷大鼠的炎癥反應[6]，本文旨在探討體外情況下Rg1 能否通過抑制NLRP3 炎癥小體在BV-2 小膠質細胞中的表達減輕腦缺血再灌注損傷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器 BV-2 小膠質細胞購自上海傳秋生物公司；人參皂苷Rg1（純度＞95%）購自吉林大學有機化學教研室；DMEM/F12 細胞培養基、胰蛋白酶、青鏈霉素雙抗購自美國Gibco 公司；BCA 蛋白定量試劑盒、RIPA 裂解液、蛋白Marker 購自TransGen Biotech 公 司；CCK-8 試 劑 購 自 美 國APExBIO 公 司；ASC、Caspase-1 抗體購自Abclonal 公司；NLRP3 抗體購自Abcam 公司；IL-1β、IL-18 ELISA 檢測試劑盒購自R&D 公司。缺氧倉購自STEMCELL 公司；高速冷凍離心機購自Thermo 公司；細胞培養箱購自Thermo公司；電泳槽、電轉儀購自Bio-Rad 公司；凝膠成像系統購自伯樂公司。

1.1.2 細胞培養 BV-2 小膠質細胞用含10% 胎牛血清、106 IU /L 鏈霉素、105 IU /L 青霉素的DMEM/F12培養基進行培養，接種于培養瓶中，調整細胞至合適密度，加入2～3 mL 培養液，將培養瓶置于37 ℃、含有95%空氣和5%CO2的孵箱中培養，每2～3天傳代1次。

1.2 實驗方法

1.2.1 氧葡萄糖剝奪/復供（OGD/R）模型構建方法OGD 模型：取對數生長期貼壁后的細胞，加入無糖培養基，放入缺氧倉中，為營造缺氧環境，向缺氧倉中通氮氣10 min 以排空倉內的氧氣，排空后密閉，放入培養箱中培養2 h，在體外模擬腦缺血損傷。OGD/R 模型：OGD 處理2 h 后取出細胞恢復氧氣供應，將無糖培養基置換為完全培養基，加入等量細胞培養液繼續培養48 h，置于含有95% 空氣和5% 的CO2孵箱中，在體外模擬腦缺血/再灌注損傷[7]。對照組細胞始終用完全培養基，并置于37 ℃、含有95% 空氣和5%CO2的孵箱中培養。

1.2.2 實驗分組 將生長狀態良好的BV-2 小膠質細胞隨機分為6 組：無處理組（Con）、氧糖剝奪/復供組（OGD/R）、人 參 皂 苷Rg1 低 劑 量 組（0.1 mmol/L，Rg1L）、人參皂苷Rg1 中劑量組（0.2 mmol/L，Rg1M）、人參皂苷Rg1 高劑量組（0.4 mmol/L，Rg1H）、MCC950對照組（0.05 mmol/L，MCC950）[8,9]。除Con 組不作任何處理外，其它各組制備OGD/R 模型后，分別加入細胞培養液、不同濃度的人參皂苷Rg1 和MCC950，置于培養箱中培養48 h。

1.2.3 CCK8 檢測細胞增殖 取對數生長期的BV-2小膠質細胞，以每孔1×104個/孔接種于96 孔板中，每孔100 μL，細胞貼壁后進行OGD/R 處理。接下來依次加入不同濃度人參皂苷Rg1 和MCC950。每組設置5 個復孔，每孔加入10 μL CCK8 試劑，放入培養箱孵育1～4 h。于450 nm 處測定OD 值。根據說明書計算細胞活力。

1.2.4 免疫熒光法檢測Iba-1、NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達水平 將聚賴氨酸防脫載玻片置入12 孔板中，六組細胞分別接種于孔板的載玻片上，調整細胞密度至2×104/ml，每孔加入1 mL 細胞懸液，培養至細胞完全貼壁后，除Con 組不作任何處理外，其它各組制備OGD/R 模型后，分別加入細胞培養液、不同濃度的人參皂苷Rg1 和MCC950，置于培養箱中培養48 h。48 h 后取出孔板，棄上清，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3次；4%多聚甲醛固定細胞30 min，固定后以PBS 漂洗3 次，每次3 min；加入0.1%Triton X-100 的PBS 溶液通透細胞膜30 min 后，漂洗3 次，每次3 min；加入5%胎牛 血 清 室 溫 封 閉60 min。 每 孔 加 入200 μL 的NLRP3、ASC、Caspase-1（稀釋比例均為1∶100）、Iba-1（稀釋比例均為1∶1000）一抗工作液后置入4 ℃冰箱過夜。次日取出孔板，加入FITC 標記的二抗工作液（稀釋比例為1∶200）室溫孵育60 min，全程避光；最后避光加入DAPI 染色劑常溫復染細胞核。在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 Western blotting 檢 測Iba-1、NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達水平 RIPA 裂解法抽提細胞總蛋白后，根據二喹啉甲酸( bicinchoninic acid，BCA) 法測定的蛋白濃度結果，將各樣品的蛋白濃度調節一致; 經過SDS-PAGE 蛋白轉印后，用含有3%BSA 封閉液將轉印好的PVDF 膜，室溫孵育，封閉1 h; 加入NLRP3、ASC（稀釋比例均為1∶1000）Caspase-1（稀釋比例為1∶2000）GAPDH（稀釋比例為1∶1500)一抗工作液，4 ℃孵育過夜;次日加入相應二抗（稀釋比例為1:2000），室溫下振搖1.5 h，以ECL發光顯色，得到條帶。

1.2.6 ELISA 法檢測IL-18、IL-1β 炎癥因子表達水平收集所有組別細胞上清液，將測試樣品按照說明書精準加液后，將孔板37 ℃水浴溫育60 min。取出孔板，吸棄所有孔內液體，洗滌并盡量拍干，重復5 次。每孔加入顯色劑反應10 min，加入終止液終止反應。10 min 內以450 nm 波長測量各孔光密度值并計算樣品濃度。

1.3 統計學分析

本實驗使用SPSS 19.0 軟件對實驗數據進行統計分析，多組樣本之間的比較采用單因素方差分析，方差齊性采用LSD，方差不齊采用Tamhane 檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人參皂苷Rg1 對OGD/R 損傷后BV-2 小膠質細胞形態的影響。

如圖1 所示, BV-2 小膠質細胞正常狀態下呈橢圓形和紡錘形，紡錘形細胞兩端有兩根細小突起[10]；經OGD/R 處理后，小膠質細胞迅速激活，表現為胞體呈正圓形，胞質出現空泡，折光度增強，此為M1(經典型)，可啟動吞噬功能、分泌促炎因子[11]。經人參皂苷Rg1 和MCC950 處理48h 后，胞體縮小，細胞呈分支狀，突起粗且長，此為M2(替代型)，主要分泌抗炎因子和神經保護介質[12]。與ODG/R 組對比，人參皂苷Rg1 和MCC950 均可促進損傷激活的BV-2 小膠質細胞由M1 向M2 轉化，起到了抑制炎癥發展的作用。

圖1 人參皂苷Rg1 和MCC950 對BV-2 小膠質細胞形態變化的影響Fig.1 Effect of ginsenoside Rg1 and MCC950 on morphological changes of BV-2 microglia cells.

2.2 Iba-1 免疫熒光法檢測BV-2 小膠質細胞的活化情況

如圖2 所示，Iba-1 通常作為活化的小膠質細胞標記物[13]。免疫熒光染色結果顯示，Con 僅有少量細胞呈現Iba-1 綠色熒光，而OGD/R 組可見大量細胞呈現Iba-1 綠色熒光表達。提示經過缺氧缺糖/復供后大量小膠質細胞被激活。

圖2 BV-2 小膠質細胞Iba-1 染色Fig.2 Iba-1 staining of BV-2 microglia cells.

2.3 CCK8 法檢測BV-2 小膠質細胞增殖情況

如圖3 所示,與Con 組比較，OGD/R 處理后，BV-2小膠質細胞增殖率顯著增高；而經過人參皂苷Rg1 和MCC950 作用于OGD/R 處理后的BV-2 小膠質細胞48 h 后，BV-2 細胞的增殖率則呈現顯著的下降趨勢，且Rg1 3 個劑量之間有顯著差異，但Rg1H 與MCC950之間無顯著差異。

圖3 各組BV-2 小膠質細胞增殖率改變與Con 組 比 較，**P＜0.01；與OGD/R 組 比 較，##P＜0.01；與Rg1L 組比較，ΔΔP＜0.01；與Rg1M 組比較，▲▲P＜0.01Fig. 3 Changes in the proliferation rate of BV-2 microglia in each group. Compared with Con group, **P＜0.01; Compared with OGD/R group, ##P＜0.01;Compared with Rg1L group, ΔΔP＜0.01; Compared with Rg1M group, ▲▲P＜0.01.

2.4 人參皂苷Rg1 對NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達的影響

如圖4、6、8 所示,免疫熒光結果顯示，Con 組僅見微弱的綠色熒光；經OGD/R 處理后呈現明顯的綠色熒光表達；低、中、高濃度人參皂苷Rg1 和MCC950 作用于OGD/R 處理后的BV-2 小膠質細胞48 h，綠色熒光表達強度明顯減弱；如圖5、7、9 所示，免疫印跡法檢測結果分析，與其它各組比較，OGD/R 組呈現最為明顯的ASC、Caspase-1、NLRP3 表達條帶。低、中、高劑量人參皂苷Rg1 和MCC950 作用于OGD/R 處理后的BV-2 小膠質細胞48h 后，細胞內NLRP3、ASC 蛋白表達明顯下調，且Rg1 3 個劑量之間有顯著差異，但Rg1H 與MCC950 之間無顯著差異;Caspase-1 的表達與上述有些許不同，與Rg1L 組比較，Rg1M 和Rg1H的表達水平顯著降低，但二者之間無顯著差異，且與MCC950 組無顯著差異。

圖4 免疫熒光法觀察各組BV-2 小膠質細胞NLRP3 表達情況Fig.4 The expression of NLRP3 in BV-2 microglia detected by immunofluorescence.

圖5 免疫印跡法檢測各組BV-2 小膠質細胞NLRP3 蛋白表達水平及柱狀圖與Con 組比較，**P＜0.01；與OGD/R 組比較，##P＜0.01；與Rg1L 組比較，ΔΔP＜0.01；與Rg1M 組比較，▲▲P＜0.01Fig.5 The protein expression level of NLRP3 in BV-2 microglia in each group detected by WB and the bar graph. Compared with Con group, **P＜0.01; Compared with OGD/R group, ##P＜0.01;Compared with Rg1L group, ΔΔP＜0.01;Compared with Rg1M group, ▲▲P＜0.01.

圖6 免疫熒光法觀察各組BV-2 小膠質細胞ASC 表達情況Fig. 6 The expression of ASC in BV-2 microglia detected by immunofluo rescence.

圖7 免疫印跡法檢測各組BV-2 小膠質細胞ASC 蛋白表達水平及柱狀圖與Con 組比較，**P＜0.01；與OGD/R 組比較，##P＜0.01；與Rg1L 組比較，ΔΔP＜0.01；與Rg1M 組比較，▲▲P＜0.01Fig. 7 The protein expression level of ASC in BV-2 microglia in each group detected by WB and the bar graph. Compared with Con group, **P＜0.01; Compared with OGD/R group,##P＜0.01; Compared with Rg1L group, ΔΔP＜0.01;Compared with Rg1M group, ▲▲P＜0.01.

圖8 免疫熒光法觀察各組BV-2 小膠質細胞Caspase-1 表達情況Fig.8 The expression of Caspase-1 in BV-2 microglia detected by immunofluorescence.

圖9 免疫印跡法檢測各組BV-2 小膠質細胞Caspase-1 蛋白表達水平及柱狀圖與Con 組比較，**P＜0.01；與OGD/R 組比較，##P＜0.01；與Rg1L 組比較，ΔΔP＜0.01；與Rg1M 組比較，▲▲P＜0.01Fig. 9 The protein expression level of Caspase-1 in BV-2 microglia in each group detected by WB and bar graph. Compared with Con group, **P＜0.01; Compared with OGD/R group, ##P＜0.01;Compared with Rg1L group,ΔΔP＜0.01; Compared with Rg1M group, ▲▲P＜0.01.

2.5 人參皂苷Rg1 對細胞因子IL-1β 和IL-18 表達的影響

ELISA 法檢測結果如圖10 所示，低、中、高劑量人參皂苷Rg1 和MCC950 作用于OGD/R 處理后的BV-2小膠質細胞48 h 后，細胞培養液中的IL-1β、IL-18 的表達明顯下調。且Rg1 3 個劑量之間有顯著差異，但均高于MCC950 組。

圖10 各組BV-2 小膠質細胞培養液中IL-1β、IL-18 蛋白表達影響與Con 組比較，**P＜0.01；與OGD/R 組比較，##P＜0.01；與Rg1L 組比較，ΔΔP＜0.01；與Rg1M 組比較，▲▲P＜0.01；與Rg1H 組比較，■P＜0.05Fig.10 Effect of IL-1β and IL-18 protein expression in the culture medium of BV-2 microglia cells in each group. Compared with Con group, **P＜0.01; Compared with OGD/R group, ##P＜0.01; Compared with Rg1L group, ΔΔP＜0.01;Compared with Rg1M group, ▲▲P＜0.01; Compared with Rg1H group, ■P＜0.05.

3 討論

腦缺血再灌注損傷是一種可嚴重影響缺血性腦卒中預后的病理生理過程，病變周圍組織會出現細胞凋亡、線粒體自噬、嚴重的氧化應激反應和激烈的級聯炎癥反應[14]。大量實驗已證實，腦缺血損傷后，缺血組織會產生嚴重的炎癥反應，血流再通后，浸潤的炎癥細胞會產生大量炎癥細胞因子加重組織損傷[15]，因此控制炎癥反應在缺血再灌注損傷中占有重要的位置。人參是指人參植物C.A.的根，是世界上使用歷史最悠久、最廣泛的草藥產品之一。人參皂苷是人參中最重要的生物活性成分，其中人參皂苷Rg1 含量最高。Rg1 可減少腦缺血再灌注損傷后細胞壞死和凋亡，減輕細胞氧化應激和炎癥反應，從而起到腦保護的作用[16]。

抵抗炎癥反應，是減輕腦缺血再灌注損傷的重要一環。在腦缺血再灌注損傷初期的幾個小時，復灌區小膠質細胞迅速聚集、增殖活化，啟動吞噬功能，清除周圍壞死細胞，分泌抗炎細胞因子和神經保護介質，發揮炎癥反應的積極作用。隨著病程的發展，小膠質細胞過度增殖活化，分泌促炎因子，加重組織損傷。因此控制小膠質細胞過度增殖活化是抑制腦缺血再灌注損傷炎癥反應的首要任務[17]。CCK-8 檢測結果顯示，經OGD/R 處理后BV-2 小膠質細胞與對照組相比增殖能力明顯增強，表明細胞激活。經不同濃度人參皂苷Rg1 處理后BV-2 小膠質細胞增殖效率明顯下降，說明Rg1 可抑制細胞激活，且具有劑量依賴性。經過NLRP3 抑制劑MCC950 處理后的BV-2 小膠質細胞同樣抑制了細胞增殖活化，提示了人參皂苷Rg1 可能是通過抑制NLRP3 炎癥小體的激活從而抑制BV-2小膠質細胞活化。小膠質細胞活化分為M1（經典型）和M2（替代型）兩種表型[18]。靜息態的小膠質細胞呈“橢圓形”或“紡錘狀”，形似眼睛，胞體兩端發出細而短的突起。使用OGD/R 模型刺激BV-2 細胞后，細胞呈“阿米巴樣”改變，胞體變大，突起回縮，細胞內出現空泡，此為M1 型[19]。經過不同濃度人參皂苷Rg1處理后，細胞變為“分枝狀”，胞體較M1 型變小，突起增加，且與靜息態相比突起較為粗長，此為典型M2型[20]。當用OGD/R 方法刺激BV-2 小膠質細胞時，細胞迅速由靜息態轉化為M1 型，M1 型為促炎狀態，產生促炎細胞因子和趨化因子，具有神經毒性作用[21]。當加入人參皂苷Rg1 和MCC950 處理后，M1 型小膠質細胞逐漸轉化為M2 型，表現為抗炎和吞噬功能，分泌抗炎細胞因子以及各種神經營養因子，同時吞噬細胞碎片，拮抗神經損傷[22]。M2 型小膠質細胞在抑制炎癥，過敏反應，組織重塑，血管再生，免疫調節中和維護內環境穩態具有重要作用[23]。諸多因素可刺激靜息狀態小膠質細胞向M1 轉化，其中NLRP3 炎癥小體的蓄積是最重要的刺激因素之一[24]。從BV-2 小膠質細胞損傷后的形態變化，提示了人參皂苷Rg1 可能具有引導激活的小膠質細胞由M1型向M2型轉化的能力，從而發揮抗炎功效，但是具體機制還有待研究。

炎癥小體是先天免疫系統的固有受體，炎癥小體主要由3 部分組成：NLRs、具有CARD 的凋亡相關斑點 蛋 白（apoptosis associated speck-like protein containing a CARD domain，ASC）以及包含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1 前體（pro-cysteinyl aspartate specific proteinase 1，pro-caspase-1），NLRP3炎癥小體是研究最為深入的炎癥小體之一[25]。許多缺血再灌注損傷后的器官，例如腦，心臟，腎臟和睪丸缺血再灌注后均發現了NLRP3 炎癥小體的蓄積[26]。NLRP3 廣泛存在于多種細胞中，在神經系統內小膠質細胞是功能性NLRP3 炎癥小體產生的主要場所[27]。已有實驗證實抑制NLRP3 炎癥小體途徑介導的炎癥反應，可顯著改善腦缺血再灌注損傷[28]。

細胞內ROS 或ATP 蓄積到一定程度后會對下游NLRP3 產生刺激，形成蛋白復合體，該蛋白復合體由NLRP3 蛋 白，ASC 和pro-caspase-1 組 成，NLRP3 炎 性復合體也是pro-caspase-1 自我催化水解的平臺，促使自身轉化為成熟的Caspase-1。Caspase-1 能夠刺激炎癥因子IL-1β 和IL-18 釋放，并參與到后續的炎癥級聯反應。我們的實驗結果顯示，經過OGD / R 誘導損傷 的BV-2 小 膠 質 細 胞 中，NLRP3、ASC 和 下 游 的caspase-1 及炎癥因子IL-18、IL-1β 的表達水平均有所上升。而經過不同濃度人參皂苷Rg1 處理激活的BV-2 小膠質細胞后NLRP3 炎癥小體及其下游產物caspase-1 均得到相應抑制，炎癥因子IL-18，IL-1β 表達同樣減少，與經典的NLRP3 炎癥小體抑制劑MCC950 結果一致。

綜上所述，人參皂苷Rg1 可抑制氧糖剝奪/復供損傷后BV-2 小膠質細胞炎癥反應，可能與抑制NLRP3、ASC 和Caspase-1 蛋白的表達、干擾NLRP3 炎癥小體合成，并減少相關炎癥因子釋放有關，但其分子機制還有待進一步研究。