依達拉奉經MAPKs 通路對脂多糖激活的小膠質細胞Sirt3 表達調控

祁志， 楊力， 賈秋葉， 陳浩倫， 段兆達， 吳春云*

昆明醫科大學基礎醫學院人體解剖與組織胚胎學系，昆明 650500

中樞神經系統（central nervous system，CNS）炎癥是感染性、自身免疫性、創傷性、脫髓鞘和神經退行性疾病等神經系統疾病的重要特征[1]。作為CNS 的免疫細胞，小膠質細胞激活介導的神經炎癥可加劇神經組織損傷或壞死，造成不可逆的病變[2]。因此，調控小膠質細胞的激活狀態有望成為治療神經炎性疾病的新方法。依達拉奉（Edaravone）是近年用于治療腦卒中、創傷性腦損傷等疾病的藥物，主要有清除自由基、抑制炎癥反應和調控細胞凋亡等作用。課題組前期研究表明，依達拉奉能抑制小膠質細胞激活、減輕腦水腫和降低腦梗死體積，對腦缺血發揮較好的神經保護作用[3]。但依達拉奉調節小膠質細胞的分子機制尚未闡明。絲分裂原激活的蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases，MAPKs）是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，主要包括細胞外信號調節激酶（ERK）、c-Jun N-末端激酶（JNK）和p38 MAPK，它們對細胞增殖、凋亡及炎癥等過程有重要調節作用。課題組前期發現，在脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）激活的BV2細胞和大鼠腦缺血模型中，燈盞乙素可通過小膠質細胞MAPKs 信號通路發揮抗炎作用[4]。沉默信息調節因子3（Sirtuin3，Sirt3）是一種脫乙?；?，在炎癥和凋亡中起關鍵作用，小膠質細胞中Sirt3 過表達可減少炎癥因子產生[5]。由于MAPKs 信號與Sirt3 變化相關，提示依達拉奉的抗炎作用可能經調控小膠質細胞中MAPKs 和Sirt3 信號而實現。本研究采用LPS 制備激活的BV2 小膠質細胞，經依達拉奉和ERK1/2 抑制劑處理，檢測MAPKs 信號通路相關因子和Sirt3 的變化，探究依達拉奉調控小膠質細胞發揮神經保護作用的可能機制，為推進依達拉奉的臨床應用提供依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞系 BV2 小膠質細胞，由新加坡國立大學林榮安教授惠贈。

1.1.2 主要材料和儀器 依達拉奉注射液（吉林博大制藥，10 mL：15 mg）；ERK1/2 抑制劑（SCH772984）購自Selleck 公司；兔抗Sirt3 抗體購自Santa-Cruz 公司，兔抗P38 和兔抗p-P38 抗體購自CST 公司，兔抗JNK、兔抗p-JNK、兔抗ERK1/2 和兔抗p-ERK1/2 抗體購自Abcam 公司；小鼠抗β-actin 抗體、HRP 標記山羊抗小鼠Ig G 和山羊抗兔Ig G 購自Protein-tech 公司；Cy3 標記的山羊抗兔熒光二抗、含DAPI 的熒光封片劑和FITC 標記的lectin（小膠質細胞標記物）購自Sigma 公司。Western blot 電泳設備、凝膠成像分析系統、凝膠成像儀購自Bio-Rad 公司；倒置熒光顯微鏡（Axio Observer Z1）購自ZEISS 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 BV2 小膠質細胞株復蘇后，置于5% CO2，37 ℃無菌培養箱中培養。細胞密度長到約80%時進行傳代；傳3 代后進行后續實驗。

1.2.2 制備及分組處理激活的BV2 細胞 細胞隨機分為對照組（Con）、LPS 激活組（LPS）和LPS+依達拉奉組（LPS+E）（n=4），6 孔板培養BV2 細胞到細胞密度約80% 時棄培養基，用PBS 清洗后加入無血清DMEM 高糖培養基（BM），并在LPS+E 組使用依達拉奉（100 μmol/L）預處理1 h 后更換BM，分別在LPS 組及LPS+E 組加入LPS（1 μg/mL）處理3 h[6]。

抑制劑實驗分為對照組（Con）、抑制劑組（I）、LPS 激活組（LPS）、LPS+抑制劑組（LPS+I）、LPS+依達拉奉組（LPS+E）以及LPS+抑制劑+依達拉奉組（LPS+E+I），細胞密度約80%時棄培養基并用PBS 清洗后加入培養基，I 組、LPS+I 組和LPS+E+I 組加入濃度為4 nM 的ERK1/2 抑制劑（SCH772984）孵育1 h（濃度參照說明書），隨后用依達拉奉（100 μmol/L）處理LPS+E 組和LPS+E+I 組1 h，最后用LPS（1 μg/mL）處理LPS 組、LPS+I 組、LPS+E 組和LPS+E+I 組3 h。上述實驗參考課題組前期研究[3]。

1.2.3 Western blot 檢測 細胞完成藥物處理后，每孔注入60 μL 預制裂解液（RIPA：PMSF：磷酸酶抑制劑=100：1：1）提取總蛋白；高溫加熱（95 ℃，5 min）使蛋白充分變性。按照實驗分組進行電泳、轉膜，時間據分子量大小而定；轉膜結束后封閉，清洗后分別加入兔抗Sirt3 抗體（1：2000）、兔抗P38 抗體（1：5000）、兔抗p-P38 抗體（1：2500），兔抗JNK 抗體（1：5000）、兔抗p-JNK 抗 體（1：5000）、兔 抗ERK1/2 抗 體（1：5000）)、兔抗p-ERK1/2 抗體（1：5000）和小鼠抗β-actin抗體（1：5000），陰性對照采用溶劑PBS 替換二抗；放置于4 ℃冰箱中搖床過夜。次日回收一抗，清洗后加入HRP 標記的山羊抗兔二抗（1：5000）、HRP 標記的山羊抗鼠二抗（1：5000），陰性對照采用溶劑PBS 替換二抗。常溫孵育后顯影并存儲。每組獨立重復實驗3 次。

1.2.4 免疫熒光雙標染色 用24 孔板培養細胞，生長密度約80%時給藥，LPS 和依達拉奉濃度不變，其余步驟同前。各組細胞制備結束后每孔加入4%多聚甲醛300 μL 固定，10%山羊血清封閉；分別滴加一抗兔抗Sirt 3 抗體（1：200）、兔抗P38 抗體（1：400）、兔抗p-P38 抗體（1：200），兔抗JNK 抗體（1：200）、兔抗p-JNK 抗體（1：200）、兔抗ERK1/2 抗體（1：200）、兔抗p-ERK1/2 抗體（1：200），陰性對照組以PBS 代替一抗，4 ℃孵育過夜，分別滴加二抗：Cy3 標記的山羊抗兔IgG（1：200）和FITC 標記的lectin（1：200），陰性對照采用PBS 替換二抗，室溫避光孵育1 h。用含DAPI 的熒光封片劑封片，熒光顯微鏡進行觀察和拍照。每組獨立重復實驗3 次。

1.3 統計學分析

用統計學軟件GraphPad Prism 8.0.2 進行單因素方差分析（one-way ANOVA），再進行兩樣本間t檢驗，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 依達拉奉促進BV2 細胞Sirt3 與p-ERK1/2 表達

Western blot 結 果 顯 示：LPS 激 活 后Sirt3 與p-ERK1/2 在BV2 細胞中的表達明顯增高（P＜0.05）；依達拉奉組Sirt3 與p-ERK1/2 的表達顯著增強（P＜0.01）。免疫熒光染色結果顯示：各組lectin 陽性細胞中，LPS 組的Sirt3 與p-ERK1/2 表達明顯增高，依達拉奉處理后Sirt3 與p-ERK1/2 表達進一步增高，與LPS組相比具有統計學差異（P＜0.01）。提示依達拉奉可促進BV2 細胞中Sirt3 與p-ERK1/2 表達，見圖1～4。

圖1 依達拉奉對BV2 細胞Sirt3 蛋白表達作用A：Western blot 條帶 B：各組Sirt3 表達量化分析（n=4）** P＜0.01Fig.1 Effect of edaravone on the Sirt3 protein expression in BV2 cells.A: Western Blot bands; B: Quantitative analysis of Sirt3 expression levels in each group (n=4); ** P＜0.01.

圖2 免疫熒光雙標染色檢測BV2 小膠質細胞Sirt3 表達A：免疫熒光雙標染色圖（標尺=20 μm）B：各組Sirt3 表達量化分析（n=4）** P＜0.01Fig. 2 Immunofluorescence result showed the Sirt3 expression in BV2 microglia. A: Representative images of immunofluorescence double-label staining ( Bar=20 μm); B: Quantitative analysis of Sirt3 expression levels in each group (n=4); ** P＜0.01.

圖3 依達拉奉對BV2 細胞p-ERK1/2 和ERK1/2 蛋白表達作用A：Western blot 條帶 B：各組p-ERK1/2 和ERK1/2 表 達 量 化分析（n=4）) ** P＜0.01Fig.3 Effect of edaravone on the p-ERK1/2 and ERK1/2 protein expression in BV2 cells. A: Western Blot bands；B: Quantitative analysis of p-ERK1/2 and ERK1/2 expression levels in each group (n=4); **P＜0.01.

圖4 免疫熒光雙標染色檢測BV2 小膠質細胞p-ERK1/2 表達A：免疫熒光雙標染色圖（標尺=20 μm）B：各組p-ERK1/2 表達量化分析（n=4）** P＜0.01Fig.4 Immunofluorescence result showed the p-ERK1/2 expression in BV2 microglia. A: Representative images of immunofluorescence double-label staining images (Bar=20 μm); B: Quantitative analysis of p-ERK1/2 expression levels in each group (n=4); ** P＜0.01.

2.2 依達拉奉抑制BV2 細胞中p-P38 與p-JNK 表達

Western blot 結 果 顯 示：LPS 激 活 后p-P38 與p-JNK 在BV2 細胞中表達增高（P＜0.05），依達拉奉組較LPS 組的表達明顯下降（P＜0.05）。免疫熒光染色結果顯示：各組lectin 陽性細胞中，LPS 組p-P38 與p-JNK表達增高（P＜0.01）；依達拉奉預處理后p-P38 與p-JNK 表達明顯降低（P＜0.01）。提示依達拉奉可抑制激活的BV2 細胞表達p-ERK1/2 與p-JNK，見圖5～8。

圖5 依達拉奉對BV2 細胞中p-P38 和P38 蛋白表達作用A：Western blot 條帶B：各組p-P38 和P38 表達量化分析（n=4）* P＜0.05，** P＜0.01Fig.5 Effect of edaravone on the p-P38 and P38 protein expression in BV2 cells.A:Western Blot bands;B: Quantitative analysis of p-P38 and P38 expression levels in each group (n=4); * P＜0.05, ** P＜0.01.

圖6 免疫熒光雙標染色檢測BV2 小膠質細胞p-P38 表達A：免疫熒光雙標染色圖（標尺=20 μm）B：各組p-P38 表達量化分析（n=4）*P＜0.05，**P＜0.01Fig. 6 Immunofluorescence showed the p-P38 expression in BV2 microglia. A: Representative images of immunofluorescence double-label staining images (Bar=20 μm); B: Quantitative analysis of p-P38 expression levels in each group(n=4); * P＜0.05, ** P＜0.01.

圖7 依達拉奉對BV2 細胞中p-JNK 和JNK 蛋白表達作用A：Western blot 條帶B：各組p-JNK 和JNK 表達量化分析（n=4）** P＜0.01Fig.7 Effect of edaravone on the p-JNK and JNK protein expression in BV2 cells. A: Western Blot bands; B: Quantitative analysis of p-JNK and JNK expression levels in each group (n=4); ** P＜0.01.

圖8 免疫熒光雙標染色檢測BV2 小膠質細胞p-JNK 表達A：免疫熒光雙標染色圖（標尺=20 μm）B：各組p-JNK 表達量化分析（n=4）* P＜0.05Fig. 8 Immunofluorescence showed the p-JNK expression in BV2 microglia. A: Representative images of immunofluorescence double-label staining images (Bar=20 μm); B: Quantitative analysis of p-JNK expression levels in each group(n=4); * P＜0.05.

圖 9 依達拉奉對ERK1/2 抑 制 后BV2 細胞中p-ERK1/2 和Sirt3作用A：Western blot 條帶 B：各組p-ERK1/2 和Sirt3 表 達量化分析（n=4）加抑制劑組 別 分 別 為I、LPS+I、LPS+E+I ** P＜0.01Fig. 9 Effect of edaravone on the p-ERK1/2 and Sirt3 expression in BV2 cells after ERK1/2 inhibition.A: Western Blot bands; B:Quantitative analysis of p-ERK1/2 and Sirt3 expression levels in each group (n=4); the inhibitor groups were respectively indicated as I, LPS+I, LPS+E+I; ** P＜0.01.

2.3 抑制ERK1/2 可下調BV2 細胞中Sirt 3 和p-ERK1/2 表達

Western blot 結果顯示：使用依達拉奉預處理LPS激活的小膠質細胞后p-ERK1/2 和Sirt3 表達明顯升高，與LPS 激活組比較有顯著性差異（P＜0.05）；ERK1/2 被抑制后，p-ERK1/2 和Sirt3 表達降低（P＜0.05），再給予依達拉奉未能明顯升高p-ERK1/2 和Sirt3 的表達（圖9）。表明依達拉奉對Sirt3 的調節可能經ERK1/2途徑實現。

3 討論

人和動物發生CNS 疾病時，小膠質細胞被激活并釋放致炎因子，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、一氧化氮（NO）、白介素1-β（IL-1β）等[7]，引發神經炎癥和神經元死亡。探明小膠質細胞介導神經炎癥的機制并適當干預是防治CNS 疾病的新方向。課題組前期對大鼠腦缺血的研究發現，依達拉奉能明顯抑制腦內激活的小膠質細胞，降低TNFα、NO 及IL-1β 表達，發揮良好的抗炎作用[3]；同時體外實驗觀察到依達拉奉能降低激活的BV2 小膠質細胞中多個炎癥因子的表達。有學者在體外實驗中發現，依達拉奉可以調節BV2 細胞的激活程度，顯著降低NO 和TNF-α 的表達[7]，與本課題組研究相一致。但這些研究并未闡明依達拉奉的抗炎機制。

MAPKs 通路被抑制時可降低小膠質細胞產生多種炎癥因子，改善大腦功能[8,9]。本研究發現：依達拉奉能有效調節BV2 細胞中p-ERK1/2、p-P38 和p-JNK的表達，可能經MAPKs 通路發揮抗炎作用。有學者認為依達拉奉可經TLR4/NF-κB/TNF-α 通路減輕小鼠腦缺血再灌注損傷[10]。Yin 等[11]發現在缺氧缺血性腦損傷時，Sirt3 具有抗氧化應激和抗炎的作用；腦缺血或氧糖剝奪的神經元中，隨Sirt3 上調神經炎癥得以減輕[12]。本研究也觀察到，依達拉奉能促進小膠質細胞表達p-ERK1/2，促進Sirt3 蛋白水平升高，當ERK1/2 被抑制后p-ERK1/2 和Sirt3 的表達均下降，說明Sirt3不僅調節炎癥反應，還與MAPKs 信號變化密切相關。有研究發現大鼠腎缺血再灌注后，上調的p-ERK1/2可促進Sirt3 恢復[13]；破骨細胞中Sir3 被抑制時，p-ERK 和p-JNK 的表達降低[14]。這些研究均提示MAPKs 通路參與調節Sir3 表達，從而發揮保護作用。由于ERK1/2 是MAPKs 通路中的關鍵因子，依達拉奉可能經ERK1/2 調控MAPKs 通路進而增加Sirt3 的表達，對激活的小膠質細胞發揮抗炎作用。對于依達拉奉調節小膠質細胞的確切機制需進一步探究。

綜合課題組研究結果表明，依達拉奉可調控小膠質細胞中ERK1/2、P38 和JNK 的磷酸化水平，促進Sirt3 表達，對小膠質細胞的抗炎作用可能經ERK/Sirt3 途徑而實現，這為闡明依達拉奉的抗炎機制提供了新的方向。由于人體內影響因素多樣，依達拉奉對中樞神經系統疾病的作用有待深入探索。