3,5-二氯水楊醛縮-4-氨基安替比林Cu(II)和Zn(II)配合物的合成、晶體結構及抗腫瘤活性研究

王佳樂,蘇 武,田文豪,張夢瑤,陸飄飄,李文戈

(蚌埠醫科大學公共基礎學院,安徽 蚌埠 233030)

席夫堿是一類穩定的亞胺化合物,最初是由德國科學家雨果·希夫在1864年報道[1],是由羰基和伯胺化合物通過親核加成、重排和脫水反應而形成的配位化合物[2]。亞胺或亞甲基在自然界中廣泛地存在,其多存在于各種天然化合物、天然衍生化合物和非天然化合物中。吡唑啉酮類是生物學、立體化學、藥理學、臨床以及分析應用的優良試劑。4-氨基安替比林是吡唑啉酮一個重要的衍生物[3-4],具有廣泛的生物活性。由于4-氨基安替比林衍生物分子中羰基和亞胺鍵的存在,容易發生配位,其常被用于配位化學中,是潛在的優良配體,并能夠與金屬離子形配合物[5],從而形成了性能各異的席夫堿金屬配合物,在制藥行業中已經得到了廣泛的應用[6-7]。

研究表明,4-氨基安替比林衍生物及金屬配合物對細菌、腫瘤、真菌均有很好的抑制作用[8-10],ROSUNT等[11]報道了4-氨基-2,3-二甲基-1-苯基-3-吡唑啉-5-酮配體的Cu(II)配合物對大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼假桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和念珠菌的生物活性,結果顯示對大腸桿菌和鮑曼假桿菌表現出高殺菌活性。JOSEYPHUS等[12]研究了咪唑-2-甲醛縮-4-氨基安替比林配體及其Co(II)、Ni(II)、Cu(II)和Zn(II)配合物對HeLa(人類宮頸癌細胞)和HCT116(結腸癌細胞)體外抗腫瘤活性研究,結果表明對HCT116細胞和HeLa細胞表現出有效的抑制作用。張淼[13]利用1-苯基-3-甲基-4-乙?；?5-吡唑啉酮、1-苯基-3-甲基-4-甲酰-5-C1-吡唑和苯甲酰丙酮與4-氨基安替比林席夫堿合成了三種新型芳基吡唑酮縮-4-氨基安替比林希夫堿并研究其對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌抗菌活性,結果顯示其對大腸桿菌和枯草桿菌具有較高抑菌活性。

綜上所述,新型4-氨基安替比林席夫堿配合物具有較好的生物活性,探索抗癌活性好的4-氨基安替比林席夫堿配合物一直是藥物工作者的研究熱點。本文通過采用3,5-二氯水楊醛與4-氨基安替比林合成一個新型的3,5-二氯水楊醛縮-4-氨基安替比林配體,再設法將3,5-二氯水楊醛縮-4-氨基安替比林配體與金屬離子利用溶劑熱反應合成具有一定抗癌活性的3,5-二氯水楊醛縮-4-氨基安替比林金屬配合物,利用X單晶衍射分析配合物的結構,并利用MTT法探究3,5-二氯水楊醛縮-4-氨基安替比林配體及金屬配合物在體外抗腫瘤的活性。

1 實驗部分

1.1 試劑及儀器

3,5-二氯水楊醛、4-氨基安替比林(均為化學純,國藥集團化學試劑有限公司)、無水乙醇(蘇州嘉鼎化學科技有限公司)、三乙胺(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、CuCl2·2H2O、Zn(Ac)2·2H2O(均為蘇州嘉鼎化學科技有限公司)、DMSO(山東捷世康)均為市售分析純;MTT體外抗腫瘤活性實驗使用的試劑和儀器是順鉑(MCE)、胎牛血清(南京維森特生物技術有限公司)、MTT(江蘇艾菱菲生物)、6孔和96孔培養板(均為上海一斗生物科技有限公司)、胰蛋白酶(Gibco)、PBS溶液(普諾賽)、人肺癌A549細胞、人鼻咽癌CNE-2Z細胞、人乳腺癌MDA-MB-231細胞(均為中國科學院上海細胞庫)。

X射線單晶衍射儀D8 Quest(Bruker Apex Smart Apex II);粉末衍射儀Bruker D8(丹東浩元儀器有限公司);紅外光譜儀Nicolet(Thermo Scientific);熱重分析儀STA449-F5分析儀(Thermo Scientific)。

1.2 配體(HL)、配合物1和2的合成路線

利用3,5-二氯水楊醛與4-氨基安替比林,通過縮合反應合成3,5-二氯水楊醛縮-4-氨基安替比林配體,再將3,5-二氯水楊醛縮-4-氨基安替比林配體與金屬Cu(II)、Zn(II)離子利用溶劑熱反應合成具有一定抗癌活性的3,5-二氯水楊醛縮-4-氨基安替比林金屬配合物1和配合物2。圖1為配體(HL)、配合物1和配合物2的合成路線。

圖1 配體(HL)、配合物1和2的合成路線

1.3 席夫堿配體(HL)的合成

精確稱取4-氨基安替比林(1.50 g, 7.38 mmol)加入無水乙醇(20 mL)三頸燒瓶(250 mL)中,攪拌溶解,再將精確稱取的3,5-二氯水楊醛(1.41 g, 7.42 mmol)完全溶解于40 mL無水乙醇,將其逐滴加入三頸燒瓶中回流5 h。反應完成后,三頸燒瓶底部有黃色沉淀生成,冷卻至室溫,將得到的產物進行減壓抽濾得到席夫堿配體粗品,再用無水乙醇洗滌2～3次,常溫下干燥,最終得到淡黃色粉末狀3,5-二氯水楊醛縮-4-氨基安替比林,配體的化學式為C18H15O2N3Cl2(產率:83 %)。

1.4 配合物[CuL2](配合物1)的合成

精確稱取席夫堿配體3,5-二氯水楊醛縮-4-氨基安替比林(0.01 g, 0.026 6 mmol)和CuCl2·2H2O(0.008 g,0.046 9 mmol)溶解于8 mL無水乙醇液中,最后加入三乙胺調節pH為8.7,混合均勻,將溶液轉移至體積為20 mL的內襯聚四氟乙烯的不銹鋼高壓反應釜中,放入烘箱,在67 ℃反應72 h后,自然冷卻至室溫,在反應瓶底部有墨綠色晶體生成,經過濾、洗滌得到墨綠色產品(產率:57%)。

1.5 配合物[ZnL2](配合物2)的合成

Zn(II)配合物的合成方法與Cu(II)合成采用類似的方法,不同的是需溶解于無水乙醇(8 mL),三乙胺調節pH為7.2,用Zn(Ac)2·2H2O(0.01 g,0.045 6 mmol)代替了CuCl2·2H2O(0.008 g,0.046 9 mmol),在65 ℃反應72 h,得到黃色棒狀晶體(產率:52 %)。

1.6 X-單晶晶體結構分析

選取配體(HL)、配合物1和配合物2,外觀較好、尺寸合適的晶體用于結構解析。單晶的X射線衍射數據在160 K和173 K條件下,用經過石墨單色器化的MoKα射線(λ=0.710 73 ?)[14],通過單晶X衍射射線測定晶體結構,在Siemens Smart CCD衍射儀上收取,并分別使用SHELXS-97[15]和SHELXL-97[16]軟件進行結構的求解和細化。表1列出了配體(HL)、配合物1和配合物2的晶體參數。

表1 配體(HL)、配合物1和配合物2的晶體學參數

1.7 配體HL、配合物1和配合物2的抗腫瘤活性實驗

使用MTT法[17]測定三種人腫瘤細胞系CNE-2Z、MDA-MB-231和A-549的增殖,將細胞在37 ℃、5% CO2下,以每孔4×103個細胞在96孔板中培養24 h,去除培養基,使用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌細胞,然后將用DMSO(1%)配制好的席夫堿配體HL、配合物1和配合物2溶液(5 mmol/L),以50、25、12.5、6.25、0 μmol/L的濃度每孔100 μL接種到96孔板,將只含DMSO(1%)不含細胞的作為對照組,37 ℃、5% CO2下條件下培養,72 h后,每孔加入10 μL的MTT溶液(0.5 mg/mL),繼續培養4 h后,使用微板讀取器在490 nm波長下測量OD值。每樣本濃度重復5個孔,取平均值計算抑制率和IC50值。

2 結果與討論

2.1 HL的分子結構

由X射線單晶衍射分析表明,配體3,5-二氯水楊醛縮-4-氨基安替比林(HL)是單斜晶系,屬于P21/n空間群。分子結構如圖2所示,3,5-二氯水楊醛通過亞胺鍵與4-氨基安替比林鍵合,4-氨基安替比林的吡唑環與3,5-二氯水楊醛的苯環幾乎共平面。

圖2 HL的分子結構

配體分子堆積如圖3所示,在配體(HL)分子中存在兩種C—H…Π相互作用。配體中4-氨基安替比林苯環幾乎垂直于另一相鄰的配體的4-氨基安替比林苯環,4-氨基安替比林苯環上的H17與另一相鄰分子4-氨基安替比林苯環形成C—H…Π堆積(距離:0.353 69 nm)。配體的3,5-二氯水楊醛苯環幾乎平行于另一相鄰的4-氨基安替比林吡唑環,3,5-二氯水楊醛苯環上H2與相鄰吡唑環形成C—H…Π堆積(距離:0.390 03 nm),最終配體分子通過C—H…Π相互作用堆積形成三維空間結構。

圖3 配體HL的分子通過C—H…Π堆積相互連接(虛線)

2.2 配合物1的晶體結構

配合物1是單核配合物,屬于單斜晶系,空間群為P21/c(表1),圖4是配合物1的分子結構圖,配合物1分子對稱單元由一個Cu(II)原子和兩個分子去質子配體(L-)組成。表2和表3分別列出了配合物1的部分鍵長和鍵角。每個Cu(II)離子由兩個O原子(O1,O1′來自配體的3,5-二氯水楊醛羥基O原子)、兩個N原子(N1,N1′來自配體的亞胺鍵的N原子)。中心離子Cu(II)的與配位原子間的鍵角O1—Cu1—N1、O1—Cu1—N1′、O1—Cu1—O′、N1—Cu1—O1′、N1′—Cu1—O1′、N1—Cu1—N1′分別對應90.717(9)°、93.640(9)°、154.548(9)°、93.640(9)°、90.717(9)°、160.132(10)°。因此,配合物1的中心離子Cu(II)形成輕微扭曲的四配位的四方形構型。

表2 配合物1和配合物2的部分鍵長

表3 配合物1和配合物2的部分鍵角

圖4 配合物1的陽離子分子結構

圖5是配合物1的分子堆積圖,配合物中3,5-二氯水楊醛的苯環與另一相鄰分子4-氨基安替比林的苯環幾乎垂直,3,5-二氯水楊醛苯環上的H6與4-氨基安替比林的苯環形成C—H…Π堆積(距離:0.342 69 nm)。最終,離散的單體配合物1分子通過C—H…Π相互作用堆積形成三維空間結構。

圖5 配合物1的分子通過C—H…Π堆積相互連接(虛線)

2.3 配合物2的晶體結構

配合物2是單核配合物,屬于單斜晶系,空間群為P21/c(表1),圖6是配合物2的分子結構圖,圖7是配合物2的分子堆積圖。配合物2分子單元由一個Zn(II)原子、兩個去質子配體(L-)組成。每個Zn(II)離子由四個O原子配位(O1、O3來自配體的3,5-二氯水楊醛酚羥基O原子,O2、O4來自配體的4-氨基安替比林羰基O原子)和兩個N原子配位(N1、N4來自配體的亞氨基N原子)組成。中心離子Zn(II)的配位原子間的鍵角在84.356(8)°到170.046(10)°之間,因此,配合物2形成了六配位的扭曲的八面體構型[18-21]。

圖6 配合物2的陽離子分子結構

圖7 配合物2的分子通過Π…Π堆積相互連接(虛線)

如圖7所示,配體的4-氨基安替比林的苯環幾乎平行于另一相鄰分子的4-氨基安替比林苯環,形成了面到面的Π…Π堆積(距離:0.384 21 nm),最終,配合物2分子通過Π…Π相互作用堆積形成3D空間結構。

2.4 紅外光譜

由圖8可知,配合物1和配合物2在1 441～1 552 cm-1范圍內有吸收峰,主要歸因于亞胺鍵的伸縮振動,相對于配體(HL)而言出現了紅移。配合物1和2在550～581 cm-1范圍內有新的吸收峰,主要歸因于N、O原子與金屬形成了配位鍵[22],證實了配體(HL)中的N、O原子分別與金屬形成了配位鍵,結果表明,紅外分析結果與配體(HL)、配合物1和配合物2的分子結構一致。

(a)配體HL (b)配合物1 (c)配合物2圖8 化合物的紅外光譜

2.5 X射線粉末衍射圖

在室溫下,采用粉末X射線衍射(PXRD)[23]驗證配合物1、配合物2的結構,如圖9所示,合成的配合物1和配合物2樣品的X射線上的衍射數據與單晶X射線衍射結構解析數據模擬進行對比,得到的衍射峰在強度和位置上完全一致,表明合成的配合物的晶體樣品的分子結構與單晶測定的分子結構相同。

(a)配合物1 (b)配合物2圖9 配合物1和配合物2的PXRD圖譜

2.6 熱重分析

對配合物1和配合物2的熱穩定性進行研究,如圖10所示,TGA分析表明,配合物1具有較高的熱穩定性,在260 ℃下質量幾乎沒有損失,在260～540 ℃范圍內質量急劇下降,失重率為44.62%,相當于失去一個3,5-二氯水楊醛縮-4-氨基安替比林希夫堿配體分子(計算值為45.98%),700 ℃后整個分子框架持續分解。配合物2也具有較高的熱穩定性,低于265.45 ℃,質量幾乎沒有損失,在265.45～550 ℃范圍內也出現質量急劇下降現象,失重率為44.57%,相當于失去一個3,5-二氯水楊醛縮-4-氨基安替比林希夫堿配體分子(計算值:45.87%),高于700 ℃,整個分子框架持續坍塌。

圖10 化合物的熱重分析TG(A)-DSC(B)

2.7 抗腫瘤活性

使用MTT方法對三種人腫瘤細胞系CNE-2Z、MDA-MB-231和A-549進行體外評估細胞毒性,檢測其48 h后對三種癌細胞活性的影響,計算配體(HL)、配合物1和配合物2的IC50值[24]。由表4可以得到,配體(HL)、配合物1和配合物2對三種癌細胞都具有一定的活性,配合物對癌細胞的抑制作用普遍比配體好,配合物1對MDA-MB-231細胞和CNE-2Z細胞抗增殖活性最好,IC50值分別為(1.215±0.07) μmol/L、(4.417±0.28) μmol/L均低于順鉑的IC50值,說明配合物1對MDA-MB-231癌細胞和CNE-2Z癌細胞具有較強的抑制增殖能力。配合物2對A-549細胞和MDA-MB-231細胞IC50值分別為(96.37±12.78) μmol/L、(43.26±6.12) μmol/L,也顯示出較好的抑制癌細胞生長的效果。以上實驗數據表明,配合物對癌細胞的IC50都比配體的IC50低,證明引入Cu(II)、Zn(II)金屬離子增加了配體的抗腫瘤活性,其中配合物1比順鉑更有效地抑制MDA-MB-231和CNE-2Z癌細胞的增殖。

表4 配體HL、配合物1和配合物2對3種人腫瘤細胞株體外IC50值

3 結論

目前GHORAB等[25]研究了利用4-氨基安替比林合成了吡唑、吡咯、嘧啶和吡唑嘧啶的新型氨基安替比林衍生物并對人體乳腺癌細胞體外抗腫瘤活性研究,結果表明,具有磺酰胺結構的部分新型吡唑類希夫堿對人體乳腺癌細胞具有良好的體外抗腫瘤活性,但未明確其準確的配合物分子結構。本文利用3,5-二氯水楊醛與4-氨基安替比林,通過縮合反應,合成3,5-二氯水楊醛縮-4-氨基安替比林希夫堿配體(HL),利用溶劑熱反應合成了配合物1和配合物2,并用X射線單晶衍射確定配體(HL)、配合物1和配合物2的分子結構,其中配合物1是四配位的四方形構型的單核配合物,配合物2是六配位的八面體構型的單核配合物,通過MTT法測定了配體(HL)、配合物1和配合物2,對3種人腫瘤細胞株的體外抗腫瘤活性,結果顯示,配合物1對MDA-MB-231癌細胞和CNE-2Z癌細胞具有較強的抑制增殖能力,且IC50值均低于順鉑的IC50值,為抗癌藥物的研發開辟了新的途徑。