基于網絡藥理學和分子對接的半枝蓮二萜類化合物抗肝癌作用機制

嚴緒華，梅格格，梅凌，方振峰

作者單位：1武漢市中醫醫院綜合藥學部，湖北 武漢 430010；2江漢大學醫學院藥學系，湖北 武漢 430056

原發性肝癌，簡稱為“肝癌”，因其具有較高的發病率和病死率，已成為我國最常見惡性腫瘤之一［1］。從病理學類型上肝癌可劃分為肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）、肝內膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）和混合型肝細胞癌-膽管癌（combined hepatocellular-cholangiocarcinoma，cHCC-CCA），三者差異較大，其中HCC 占75%～85%，在我國肝癌病人中比較常見［2］。目前，對肝癌的治療普遍存在復發概率高、手術困難、肝源缺乏、預后較差等問題［3］。中醫藥作為我國傳統醫學已存在幾千年，其在腫瘤治療方面有自己獨特之處?，F代藥理發現部分中藥可通過抑制癌細胞增殖、阻滯細胞周期、誘導癌細胞凋亡、提高免疫力和調節信息通路等來達到預防或治療肝癌的目的［4］。因此，從傳統中藥中尋找抗癌活性成分引起了科研工作者的廣泛興趣［5-10］。

半枝蓮，民間又稱為狹葉韓信草（廣州植物志），水韓信（廣西藥用植物圖志）等［11］，為唇形科（Labiatae）植物半枝蓮Scutellaria barbataD.Don的干燥全草，多年生草本植物，常見于田邊溝渠或濕潤的草地，國內主產于河北、山東、陜西南部、河南、江蘇、浙江等地區［12］。半枝蓮作為一種常見的抗癌作用的中藥，其單味藥或復方用藥常用于治療胃癌、乳腺癌、肝癌等［10-11，13］。半枝蓮在抗腫瘤方面的研究主要集中在黃酮類成分［14-17］以及多糖類成分［18-20］，但近幾年，人們陸續發現其二萜類成分（包括二萜生物堿類）也具有較好的抗腫瘤作用［21］，這引起了人們對半枝蓮中二萜類化合物的興趣。在前期研究中，本團隊發現半枝蓮生物堿富集部分（主要為二萜及二萜生物堿類化合物）表現出較明顯的抗HepG2 肝癌細胞毒活性［22］，同時，嚴威［23］報道了5 個半枝蓮二萜類化合物能逆轉腫瘤細胞HepG2/ADR（阿霉素耐藥株）多藥耐藥活性。但目前對半枝蓮二萜類化合物抗肝癌作用機制未見文獻報道。有鑒于此，本研究擬采用網絡藥理學和分子對接聯用的方法探討半枝蓮二萜類化合物抗肝癌可能的潛在靶點和通路，為進一步深入研究二萜類化合物抗肝癌相關作用機制提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 半枝蓮二萜活性成分的篩選利用scifinder數據庫，以“Scutellaria barbata”為關鍵詞進行主題搜索（1987 年1 月至2022 年7 月），從所檢索出的文獻中獲取半枝蓮二萜類化合物（包含二萜生物堿類化合物）。使用PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）對所得化合物進行確認，對于未收錄的化合物用ChenDraw 進行繪制，所有化合物結構均以sdf 格式文件保存。利用SwissADME 數據庫［24］（http：//www.swissadme.ch/）預測化合物的生物利用度及類藥性。設定胃腸道吸收為“高”結果作為藥物可以被吸收的條件，用于篩選具有較好口服生物利用度的活性化合物；設定5 種類藥性（ Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge） 預結果中有2 個及2 個以上為“是”的化合物，即可作為活性化合物。

1.2 半枝蓮二萜活性成分靶點的預測在Swiss 靶點預測數據庫［25］（http：//www.swisstargetprediction.ch）中依次導入sdf格式的半枝蓮二萜活性化合物結構，進行靶點預測。物種參數設置為“智人”，以可能性（Probability）大于0 為條件，得到相關的靶點信息。選擇每個活性化合物可能性最高的20 個預測靶點，刪除重復。再利用Uniprot 數據庫（https：//www.uniprot.org/uploadlists/），設置物種為“human”，將預測的靶標蛋白名稱轉換為所對應的基因名。

1.3 肝癌疾病靶點的獲取利用GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）、OMIM 數據庫（https：//omim.org/）、PharmGKB 數據庫（https：//www.pharmgkb.org/）、TherapeuticTargetDatabase（TTD） 數據庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank數據庫（https：//go.drugbank.com/）、The Cancer Genome Atlas（TGCA）數據庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）和Gene Expression Omnibus（GEO）數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），以“liver cancer”“HCC”為關鍵詞篩選疾病靶點，設置物種為“智人”，將7個數據庫獲得的結果進行整理，并去掉重復靶點，得到最終疾病靶點。

1.4 半枝蓮二萜“活性成分-抗肝癌靶點”網絡構建利用在線作圖工具VENNY 2.1（http：//www.liuxiaoyuyuan.cn/）對半枝蓮二萜活性成分預測靶點和肝癌疾病靶點取交集，得到半枝蓮二萜治療肝癌的潛在作用靶點。將半枝蓮二萜活性成分和交集靶點分別導入Cytoscape 3.7.2 軟件［26］，構建半枝蓮二萜“活性成分-抗肝癌靶點”可視化網絡，并進行美化。根據度值篩選出核心半枝蓮二萜活性化合物。

1.5 蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡圖的構建及核心靶點的篩選將“1.4”項中得到的半枝蓮二萜治療肝癌的潛在作用靶點導入String 數據庫（https：//www.string-db.org/），物種設定為“智人”，將最低相互作用分值設為 “highest confidence（0.900）”，在“網絡顯示選項”里選擇隱藏沒有相互作用聯系的節點，其他參數設置保持不變，得到PPI關系，導出相應的相互關系數據文件到 Cytoscape中進行可視化分析并進行美化；利用cytoHubba 插件篩選出評分前10 的核心靶點，繪制核心靶點的可視化網絡圖。

1.6 基因本體（GO）富集分析和KEGG 通路分析利用R 語言將核心靶點基因轉換成基因ID，并利用相應的軟件包對基因進行GO 富集分析和KEGG 通路分析，將P＜0.05作為篩選標準。

1.7 分子對接將篩選出的半枝蓮二萜活性化合物用ChemDraw 軟件繪制成3D 結構，同時在PDB 蛋白質結構數據庫（https：//www.pdbus.org/）中找出篩選出的關鍵靶點相對應的靶點蛋白晶體結構，并用Pymol 軟件將蛋白晶體進行處理，分離出各自的原始配體。使用Autodock Tool 軟件對活性成分、靶點蛋白晶體結構、原始配體進行處理，各自保存為pdbqt 格式；找出靶點蛋白和原始配體的“grid box”，作為活性口袋，并進行原始配體對接驗證。使用Autodock Vina 1.1.2［27］進行靶蛋白和活性成分之間的對接，選取合適的構象，使用Pymol 軟件對各關鍵靶點對接結果進行可視化分析。

2 結果

2.1 半枝蓮二萜活性成分的篩選通過Scifinder數據庫進行文獻檢索，共獲得155 個半枝蓮二萜類化合物（表1）。利用SwissADME 數據庫進行化合物的生物利用度及類藥性預測，同時取胃腸道吸收為“高”作為藥物可被吸收的條件，共獲得符合條件的93個半枝蓮二萜類化合物。

表1 半枝蓮二萜類化合物SwissADME及SwissTargetPrediction 篩選結果

2.2 半枝蓮二萜活性成分靶點的預測將上述符合生物利用度及類藥性預測的半枝蓮二萜類化合物分別導入SwissTargetPrediction 數據庫預測活性成分的靶點，根據靶點預測的可能性（大于0），最終得到65 個活性化合物（見表1），取每個活性化合物預測可能性最高的20 個靶點，刪除重復，最終得到363個基因靶點。

2.3 肝癌疾病靶點獲取結果在7 個數據庫中依據關鍵詞篩選疾病靶點，其中GeneCards 數據庫16 804 個、OMIM 數據庫173 個、PharmGKB 數據庫295 個、TherapeuticTargetDatabase（TTD） 數據庫14個、DrugBank 數據庫193 個、TCGA 數據庫17 439個、GEO 數據庫（GEO 登錄號：GSE84402）差異基因1 242個，整理后去掉重復靶點后得到20 546個疾病靶點。

2.4 “活性成分-靶點-肝癌”網絡構建利用在線作圖工具對半枝蓮二萜活性成分的363個預測靶點和肝癌疾病的20 546 個靶點取交集，繪制Venn 圖，得到潛在作用靶點360 個。將交集靶點和65 個半枝蓮二萜活性成分導入cytoscape 軟件，構建“活性成分-靶點-肝癌”網絡圖（圖1），包括426 個節點和1734 條邊。度值越大，節點越大，選取其中度值排名前5 的化合物作為半枝蓮二萜主要活性成分，分別為Scutebarbolide I（度值28）、Scutellone F（度值25）、Scutellone H（度值25）、Scutelinquanine D（度值25）、Scutebarbatine J（度值24）和Scutebata O（度值24）。

圖1 半枝蓮二萜“活性成分-靶點-肝癌”網絡

2.5 PPI 網絡圖的構建及核心靶點的篩選將半枝蓮二萜治療肝癌的360 個潛在作用靶點導入String 數據庫，得到蛋白相互作用圖。將數據導出后用cytoscape進行相應處理，得到PPI網絡圖（圖2），包括264 個節點，981 條邊，其中度值越大，節點越大，顏色也越深；連接評分越高，邊越粗，顏色也越深。利用cytoHubba 插件進行核心靶點的篩選，設置為以“Degree”值（度值）進行評價，得到評分排名前10 的靶點（表2），同時得到核心靶點的PPI 網絡可視圖（圖3），包括10 個節點，27 條邊，其中靶點顏色越深表示其越重要。從PPI 圖中可以看出，STAT3、MAPK1、MAPK3、HSP90AA1、PIK3R1 和PIK3CA 這6 個蛋白在網絡中與其他靶點的相關性更明顯，關聯更密切，可能是半枝蓮二萜治療肝癌的關鍵靶點。同時，我們發現在關鍵疾病靶點和“2.4”項所得核心化合物之間直接關系不明顯，僅Scutelinquanine D 與MARPK1，Scutebarbatine J 與MARPK1、PIK3CA 有直接關系，因此，還需要通過分子對接來預測關鍵靶點和核心化合物之間的是否有相互作用。

圖2 半枝蓮二萜治療肝癌的蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡圖

圖3 半枝蓮二萜治療肝癌的核心靶點蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）圖

表2 半枝蓮二萜治療肝癌的核心靶點

2.6 GO 富集分析和KEGG 通路分析對篩選出的10個核心靶點進行GO富集分析，共獲得953條P＜0.05 的GO 功能條目，其中766 條涉及生物過程、45條涉及細胞成分、142 條涉及分子功能，各選取排名前10 的條目繪制GO 功能氣泡分析圖，見圖4。從圖中可以看出，生物過程主要涉及肽基-絲氨酸磷酸化、肽基-絲氨酸修飾、DNA 代謝過程的調節、蛋白質輸入、DNA 代謝過程的正調控、細胞內轉運的調節、細胞對化學應激的反應、鎘離子響應、細胞器遺傳、高爾基遺傳等過程；細胞成分主要涉及囊腔、無花果素-1-富含顆粒管腔、無花果素-1-富含顆粒、轉移酶復合物等；分子功能主要涉及磷酸酶結合、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、蛋白磷酸酶結合、蛋白絲氨酸激酶活性和蛋白磷酸酶結合等。

圖4 半枝蓮二萜治療肝癌核心靶點基因本體（GO）富集分析（前10）

對篩選出的10 個核心靶點進行KEGG 通路分析，設置P＜0.05，共獲得137 條富集通路，按照P值小且基因靶點數較多的原則篩選出前20條通路，并對其做通路富集氣泡圖，見圖5，包括癌癥中蛋白多糖、化學致癌受體激活、催乳素信號通路、癌癥程序性死亡受體配體1（PD-L1）表達和程序性死亡受體1（PD-1）檢查點通路、內分泌抵抗、孕酮-介導卵母細胞成熟、FoxO 信號通路、雌激素信號通路、脂質與動脈粥樣硬化、人巨細胞病毒感染、冠狀病毒病-新型冠狀病毒感染（COVID-19）、胰腺癌、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制劑抵抗等。

圖5 半枝蓮二萜治療肝癌的京都基因和基因組數據庫（KEGG）通路富集分析

2.7 分子對接分子對接結果（表3）顯示，除了Scutellone F、Scutellone H 和Scutebarbatine J 與PIK3R1 結合能大于-20.9 kJ/mol 外，核心活性化合物Scutebarbolide I、Scutebata O、Scutelinquanine D、Scutellone F、Scutellone H 和Scutebarbatine J 與關鍵靶點的最低結合能均低于-20.9 kJ/mol，表明核心活性化合物能與關鍵靶點有良好的結合力［28］，其中Scutebata O、Scutelinquanine D 與MAPK1 結合能強于其特異性配體CQ8，Scutebata O、Scutelinquanine D 與PIK3CA 結合能強于其特異性配體VBS，Scutebarbolide I 與MAPK3 結合能強于其特異性配體5ID。以上結果表明活性成分與關鍵靶點具有較強的結合活性，尤其與MAPK1 和PIK3CA 兩靶點結合活性更強?；衔锱c靶點之間的相互作用見圖6，從圖中可知，MAPK1 主要是通過殘基ASP-104、ASN-152、SER-151、MET-106 中羰基以及ASP-109、ALA-33 中O 或N 原子與配體活潑H 之間形成氫鍵相結合；MAPK3 主要通過殘基ASP-184 中羰基以及CYS-183 中巰基與化合物Scutebarbolide I 中活潑氫形成氫鍵相結合；而PIK3CA主要通過殘基GLU-849中羰基和配體活潑氫形成氫鍵以及殘基SER-854中羥基氫與配體中羰基形成氫鍵相結合。

圖6 半枝蓮二萜主要活性化合物與關鍵靶點的分子對接

表3 半枝蓮二萜關鍵靶點和活性成分的分子對接結果

3 討論

肝癌是臨床上常見的一種惡性腫瘤疾病，可由多種病因造成，其中肝炎病毒的感染、化學致癌物質是形成肝癌的主要誘因［29-30］。近些年，許多中藥在治療肝癌過程中療效明確，毒副作用較少，能有效地緩解肝癌相關并發癥，且能有效抑制肝癌細胞轉移，降低術后復發率［10］。半枝蓮作為傳統抗腫瘤中藥，在臨床上對肝癌有較好的療效［31-32］。近幾年，半枝蓮二萜類化合物，包括二萜生物堿類化合物對抗肝癌細胞毒活性的引起了人們的關注［22-23，33］，但其作用機制未見文獻報道。

本研究通過對半枝蓮相關研究文獻的檢索，得到半枝蓮二萜類化合物，并通過SwissADME 數據庫和Swiss 靶點預測數據庫篩選得到活性化合物65個，同時得到活性成分的預測靶點363個；其與疾病靶點交集得到的360 個潛在靶點，經過PPI 網絡分析，篩選得到10 個核心靶點，其中STAT3、MAPK1、MAPK3、HSP90AA1、PIK3R1 和PIK3CA 為度值最高的6個靶點，它們和其他靶點的關聯性明顯，可能為半枝蓮二萜治療肝癌的關鍵靶點。研究表明，STAT3 是一種關鍵的致癌轉錄因子，也是癌癥治療的有吸引力的靶標［34］。STAT3 參與肝癌細胞的增殖、侵襲與轉移，也促進肝癌細胞抗凋亡及免疫逃逸，是傳染性病原體誘發肝癌發生的炎癥介質，能促進肝癌細胞上皮-間質轉化［35］。MAPK1（又名細胞外調節蛋白激酶2，ERK2）和MAPK3（又名細胞外調節蛋白激酶1，ERK1）為MAPK 家族中ERK 成員。肝炎病人的肝內細胞因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）、炎癥趨化因子等表達增加，會激活ERK 信號通路，使肝細胞異常增殖，誘發肝癌［36］。另外，有研究表明ERKl 可能是耐藥基因表達的上游調控元件，從而作為逆轉肝癌耐藥性的分子靶點［37］。有研究表明，HSP90AA1 在丙型肝炎病毒（HCV）誘導的HCC中表現為過表達，可以作為檢測此類HCC 進展的生物標志物［38］。PIK3R1（即P85 或P85-α）和PIK3CA［即磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）-α 或P110-α］為PI3K家族中最經典的IAPI3K。有研究證實，PI3K 的p85調節亞基在肝臟中起到生長因子信號傳導抑制劑和新型腫瘤抑制因子的作用，增加或恢復p85 的表達可能代表一種潛在癌癥治療可能性［39］；PIK3CA通過激活下游的蛋白激酶B（AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路誘導肝癌的發生，因此，抑制PI3K/AKT/mTOR 通路可能成為肝癌治療的一個有效方法［40］。半枝蓮二萜類成分可能是通過對上述多個靶點的信號調控達到治療肝癌的作用。

血管內皮生長因子受體（VEGFR）包含VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3 三種亞型，其中VEGFR-2 直接參與血管生成，介導內皮細胞的生長和滲透，與腫瘤的增殖、侵襲性有關［41］。癌癥中蛋白多糖主要影響腫瘤細胞生長因子的信號傳導和增殖作用?；瘜W致癌物質是導致肝癌的重要因素，部分化學物質通過與DNA 發生反應改變遺傳信息從而在致癌過程中起啟動的作用，部分通過增加細胞增殖而增加癌癥風險［42］。腫瘤細胞通過調節PD-L1 的表達，能和PD-1 受體相結合，并進一步激活T 細胞凋亡，從而通過抑制CD8+T 和CD4+T 細胞的活化開啟逃避宿主細胞免疫監視的功能［43］。人巨細胞病毒（CMV）初次感染人體后終身潛伏體內，CMV 影響細胞的信號傳送和增殖的調控而誘導原癌基因的表達，使肝癌病人免疫功能降低而致使體內潛伏感染的被激活而引起增殖性感染，增加了死亡風險［44］。GO 富集分析表明，半枝蓮二萜成分通過肽基-絲氨酸磷酸化、肽基-絲氨酸修飾、DNA 代謝過程的調節、蛋白質輸入、DNA 代謝過程的正調控、細胞內轉運的調節、細胞對化學應激的反應、鎘離子響應等生物過程，囊腔、無花果素-1-富含顆粒管腔、無花果素-1-富含顆粒、轉移酶復合物等細胞組成，磷酸酶結合、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、蛋白磷酸酶結合、蛋白絲氨酸激酶活性和蛋白磷酸酶結合等分子功能治療肝癌。KEGG 通路富集結果表明半枝蓮二萜成分通過癌癥中蛋白多糖、化學致癌受體激活、催乳素信號通路、癌癥PD-L1 表達和PD-1 檢查點通路、內分泌抵抗、孕酮-介導卵母細胞成熟、FoxO 信號通路、雌激素信號通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑抵抗等信號通路治療肝癌。

分子對接結果顯示，半枝蓮二萜成分中度值排名前5的活性成分Scutebarbolide I、Scutebata O、Scutelinquanine D、Scutellone F、Scutellone H 和Scutebarbatine J 與核心靶點STAT3、MAPK1、MAPK3、HSP90AA1、PIK3R1 和PIK3CA 有較好的結合位點，最低結合能在-17.6～-38.1 kJ/mol，主要以氫鍵結合力為主。其中化合物Scutebarbolide I、Scutelinquanine D、Scutebata O 和Scutebarbatine J 為二萜生物堿類化合物，和靶點MAPK1、PIK3CA 結合力最好，部分化合物的最低結合能甚至超過靶點的特異性配體的最低結合能，提示半枝蓮二萜生物堿類化合物可能在半枝蓮二萜治療肝癌中具有重要的地位，其作用可能和對MAPK1、PIK3CA靶點的調控有關。

綜上所述，本研究采用網絡藥理學結合分子對接技術探究了半枝蓮二萜類化合物治療肝癌的物質基礎和作用機制，表明半枝蓮二萜類化合物治療肝癌具有多成分、多靶點、多通路、多機制的特點，同時也表明半枝蓮二萜生物堿類化合物在肝癌的治療中可能具有潛在的價值，為半枝蓮治療肝癌的深入研究提供理論基礎和科學依據。

（本文圖1～3見插圖3-3，圖4～6見插圖3-4）