釀酒酵母對濃香型白酒酒醅微生物群落結構及功能的影響

馬世源，李子健，2，羅惠波，2，孫躍鵬，李 津，黃 丹，2*

（1 四川輕化工大學生物工程學院 四川自貢643000 2 釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室 四川自貢643000 3 宜賓今良造制酒有限公司 四川宜賓 644000）

濃香型白酒在中國是最受歡迎的白酒，具有窖香濃郁、口感柔和甘冽、回味悠長等特點[1]。濃香型白酒的釀造包括蒸煮、拌曲、酒醅密封發酵、蒸餾、貯存、勾調等工序[2]。在白酒釀造過程中，酒醅窖內發酵是最重要的過程。由于濃香型白酒釀造過程是開放式發酵，因此不同來源的微生物相互作用、此消彼長，形成具有釀造功能的微生物菌群，并利用底物產生多種代謝物，包括醇類、酯類、酸類、醛酮類等，它們是白酒中風味物質的直接來源[3]。

添加功能菌是提高酒醅中揮發性風味物質的一種常見的方式。黃曉寧等[4]將兩株高產淀粉酶和蛋白酶能力的芽孢桿菌用于清香型白酒發酵過程，使得酒醅中4-乙基-2-甲氧基苯酚、辛酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、四甲基吡嗪等風味物質的含量升高。楊陽等[5]通過向濃香型酒醅中添加貝萊斯芽孢桿菌，提高了己酸和己酸乙酯的含量。王曉丹等[6]在醬香酒醅中添加德巴利酵母，增加了酒醅中的多元醇含量。

然而，酒醅在混菌體系下的發酵過程中，代謝物的產生是以微生物組的形式實現的，單個物種的增加會擾動整個微生物群落結構，這導致微生物群落的代謝難以預料[7]，甚至導致某些目標代謝物的含量降低[8-9]。之前的酒醅微生物研究中，有關微生物與酒醅微生物群落的互作以及對代謝功能的擾動研究較少。此外，釀酒酵母是濃香型白酒中最重要的功能菌[10]，其具有產醇、產酯等多種重要功能[11]，然而其對酒醅微生物組的影響鮮有報道。本研究以釀酒酵母為對象，在實驗室條件下實現酒醅固態發酵?；诟咄繙y序、頂空固相微萃取氣相色譜-質譜聯合用技術（HS-SPME-GC-MS）、隨機森立機械學習算法、共現性網絡模型、PICRUST2 功能預測、通路富集研究釀酒酵母對酒醅微生物生態網絡、揮發性代謝物、群落功能的擾動作用。

1 材料與方法

1.1 材料與方法

1.1.1 樣品和主要試劑 由濃香型白酒酒醅中分離篩選的1 株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae Y2）。本研究用酒醅、黃水、大曲均來自四川省宜賓市某濃香型白酒酒廠。

乙酸正戊酯（色譜純級），安捷倫科技（中國）有限公司；乙醇、異丙醇（均為分析純級），成都科隆化學品有限公司；土壤試劑盒，美國Omega 公司。

1.1.2 主要儀器 Illumina MiSeq 高通量測序平臺，美國Illumina 公司；5975B-7890A 氣相色譜-質譜聯用儀，安捷倫科技（中國）有限公司；50/30 μm VB/CAR on PDMS 萃取頭，上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酒醅發酵試驗 在實驗室條件下，依據濃香型白酒發酵工藝進行發酵試驗[2]，發酵試驗流程如圖1 所示。取某酒廠生產線上拌曲后的入窖酒醅，分裝至滅菌后的磨口瓶中，每瓶500 g。分別加入酒醅質量2%的黃水，試驗組加入酒醅質量1%的濃度為107CFU/mL 的菌液?？瞻捉M補足相應水分。密封后放入培養箱中發酵，依據實際生產過程窖內溫度變化規律設置培養箱溫度，空白組15瓶，試驗組15 瓶。取發酵的第0，9，16，23，40 天的樣品進行后續分析?？瞻捉M標記為K，試驗組標記為S。

圖1 酒醅發酵試驗流程圖Fig. 1 Flow chart of fermentation experiment of fermented grains

1.2.2 酒醅總DNA 提取 酒醅DNA 提取使用土壤試劑盒，混合后經核酸濃度儀檢測DNA 濃度，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 條帶長度，合格后取100 μL DNA 樣品置于-80 ℃保存。

1.2.3 PCR 擴增與測序 細菌16S rRNA 基因的高變區V3-V4 用引物對338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCA GCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'），以及內部轉錄間隔（ITS）真菌基因區域用引物對ITS1F（5'-CTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和2043R（5-GCT GCGTTCTTCATCGATGC-3'）進行擴增。

PCR 反應條件：98 ℃2 min；98 ℃15 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，29 個循環；72 ℃5 min。PCR 擴增產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度及片段完整性。

合并純化的擴增子，并根據標準方案在Illumina Nova Seq PE300 平臺上通過配對末端測序進行分析。

1.2.4 酒醅揮發性代謝物的提取與檢測 稱取3 g 酒醅樣品于頂空瓶中，加入2 g NaCl，20 μL 內標物（乙酸正戊酯），50 ℃平衡5 min，插入50 μm/30 μm VAB/CAR/PDMS 固相微萃取頭，萃取45 min，解析3.5 min[12]。

氣相色譜條件：DB-WAX 毛細管色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃，不分流進樣；升溫程序：起始溫度50 ℃，維持2 min，然后以4 ℃/min 升溫至230 ℃，維持5 min；氦氣以1 mL/min 的恒定流速作柱載氣。

質譜條件：電子電離源（Electron ionization，EI），電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度100 ℃，恒壓10 Pa，全掃描。

1.2.5 數據處理與分析 使用fastp（version 0.20.0）軟件對原始測序序列進行質控[13]，使用FLASH[14]（version 1.2.7）軟件進行拼接。使用UPARSE[15]軟件（version 7.1），根據97%[16]的相似度對序列進行OTU 聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier[17]（version 2.2）對每條序列進行物種分類注釋。隨機森林模型的構建使用R 軟件（v.3.6.1）random-Forest 包。使用igraph R 包（v.1.2.6）構建共現性網絡。使用PICRUSt2 軟件包，基于16S rRNA序列和京都基因與基因組百科全書（KEGG）數據庫對不同樣本進行功能預測。PLS-DA 用于建立模型，使用SIMCA-P 13 軟件區分樣品和揮發性代謝物。使用clusterProfiler 包進行富集分析，使用pathview 包進行代謝途徑整合和可視化。

2 結果與分析

2.1 釀酒酵母對微生物群落結構的影響

采用高通量測序技術分析發酵過程中微生物群落結構的變化，發現試驗組微生物群落結構較空白組出現較大改變。細菌群落的變化如圖2a 所示，發酵第8 天，空白組的優勢微生物為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和醋酸桿菌屬（Acetobacter），而試驗組細菌群落幾乎完全被乳酸桿菌屬占據。隨著發酵的進行，試驗組與空白組的乳酸桿菌屬均呈現不同程度的下降，空白組中的醋酸桿菌屬在發酵過程中持續存在并保持一定的相對豐度，而試驗組中醋酸桿菌的相對豐度始終很低。此外，在發酵過程中類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）在試驗組的相對豐度也低于空白組。真菌群落的變化如圖2b 所示，空白組未分類曲霉菌科（unclassified_f_Aspergillaceae）的相對豐度在第8 天急劇下降，曲霉屬（Aspergillus）的相對豐度迅速上升，之后的發酵過程中，其相對豐度在小范圍內波動。而試驗組中，隨著發酵的進行未分類曲霉科仍保持較高的相對豐度。此外，較空白組而言，發酵過程中酵母屬（Saccharomyces）、熱子囊菌屬（Thermoascus）、未分類曲霉科的相對豐度明顯增高，而曲霉屬、伊薩酵母屬（Issatchenkia）的相對豐度明顯降低。因此，釀酒酵母的生物擾動改變了較多微生物的相對豐度。這是由于微生物間存在多種互作關系[18]，生物擾動改變了群落中微生物間原有的關系，導致部分微生物的生長受到群落中其它微生物的抑制或促進，進而使發酵過程中部分微生物的相對豐度發生較大改變。

圖2 屬水平上試驗組與空白組細菌（a）、真菌（b）群落組成變化Fig. 2 Changes in bacterial（a）and fungal（b）community composition between the experimental group and the blank group at the genus level

為進一步探究試驗組與空白組間微生物群落的差異，基于隨機森林機械學習算法對其進行分類預測。如圖3a，3b 所示，試驗組與空白組細菌群落和真菌群落在屬水平上具有顯著的差異。如圖3c，3d 所示該模型預測了對試驗組與空白組分類具有重要貢獻的微生物，并依據其重要性對其進行排序。為保證預測結果的準確性，基于十折交叉驗證對該模型進行檢驗，其結果如圖3e，3f 所示，細菌群落重要性排名前5 和真菌群落重要性排名前31 的微生物預測結果具有較高的準確性。依據其重要性值，篩選細菌群落排名前5，真菌群落排名前15 的微生物作為生物標志物，即：醋酸桿菌屬、湖沉積桿菌屬（Limnobacte）、類芽孢桿菌屬、乳酸桿菌屬、不動桿菌屬（Acinetobacter）可作為細菌群落的標志微生物。酵母屬、梗孢酵母屬（Sterigmatomyces）、節擔菌屬（Wallemia）等15 種真菌可作為真菌群落的生物標志物。這些生物標志物的相對豐度在試驗組和空白組中具有較大的差異，其對試驗組與空白組的分類具有重要貢獻，因此它可反映釀酒酵母對酒醅微生物群落結構的影響。生物標志物中較多屬于酵母菌目（Saccharomycetales）和曲霉科（Aspergillaceae），酵母菌目能夠參與底物的糖化、酯類物質的合成以及酒精發酵[19-20]，而曲霉能夠產生廣泛的水解酶，用于淀粉糖化、蛋白質水解和類黃酮的形成[21-22]，進而產生大量的次生代謝物。釀酒酵母在改變酒醅微生物組成的同時，也可能導致微生物群落代謝的改變。

圖3 基于隨機森林分析的細菌群落（a）和真菌群落（b）的樣本分布圖、細菌群落（c）和真菌群落（d）的重要性特征圖、細菌群落（e）和真菌群落（f）預測結果的十折交叉驗Fig. 3 Sample distribution map of bacterial community（a）and fungal community（b）based on random forest analysis，importance map of bacterial community（c）and fungal community（d），10-fold cross-validation of bacterial community（e）and fungal community（f）prediction results

2.2 釀酒酵母對酒醅微生物生態網絡的影響

部分物種的變化在一定程度上影響整個微生物群落。為研究釀酒酵母對發酵過程中微生物間互作以及群落穩定性的影響，構建試驗組與空白組的共現性網絡模型，計算模型的拓撲性質。如圖4a，4b 所示，空白組共網絡模型中，共有215 個節點，1 868 條邊，正相關占比76.71%，負相關占比23.29%。試驗組的微生物共現性網絡共有201 個節點，2 263 條邊，正相關比例占85.64%，負相關占比14.36%。釀酒酵母的擾動導致共現性網絡模型中的伽瑪變形桿菌綱（Gammaproteobacteria）和酵母菌綱（Saccharomycetes）、桿菌綱（Bacilli）所占的比例增加，而傘菌綱（Agaricomycetes）、座囊菌綱（Dothideomycetes）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）的比例下降，這說明共現性網絡模型中組成成分發生改變。試驗組的邊數、正相關性比例，平均度、平均加權度、圖密度、平均聚類系數均大于空白組；負相關比例、網絡直徑、模塊化、平均路徑長度試驗組均小于空白組。這些結果說明試驗組微生物群落間的相互關系更加復雜，網絡中微生物被共享程度更高，種間相互作用的傳遞性更強。綜上，試驗組微生物群落的復雜程度高于空白組，這表明當群落中的菌受到外部影響時，試驗組能夠更有效、快速地將這些影響傳遞至其它生物。這些性質導致試驗組的微生物群落生長、繁殖、代謝更加旺盛，更有利于底物的轉化與利用[23]。然而當酒醅發酵環境發生變化時，這種因環境變化導致的影響會在復雜度更高的試驗組中更快地傳遞，造成更大的影響[24]，因此，試驗組的微生物群落穩定性相對空白組更低。綜上所述，釀酒酵母造成的擾動促進了酒醅微生物在發酵過程中的生長和代謝，而降低了其應對環境變化的能力。

圖4 空白組（a）與試驗組（b）的共現性網絡分析Fig. 4 Co-occurrence network analysis of blank group（a）and experimental group（b）

2.3 釀酒酵母對酒醅中揮發性代謝物的影響

采用HS-SPME-GC-MS 在酒醅中共檢出65種揮發性代謝物。如圖5 所示，乙酸乙酯、乙酸、正己酸乙酯、己酸、異戊醇、苯乙醇在試驗組和空白組中均具有較高的濃度。這些揮發性代謝物，在第0 天的濃度較低，隨著發酵的進行，其濃度均逐漸增大，絕大多數揮發性代謝物在第23 天達到最高濃度。此外，乙酸乙酯、乳酸、異戊醇、苯乙醇、辛酸乙酯、十六酸乙酯、2，3-丁二醇等物質在發酵結束時，試驗組的濃度均高于空白組。這些揮發性代謝物能夠賦予酒體的香氣，對濃香型酒體風味的形成具有較大貢獻[25]。綜上，釀酒酵母的生物擾動在導致酒醅中較多揮發性代謝物的濃度增加的同時，也會影響白酒酒體中部分呈香物質的含量。

圖5 發酵過程中揮發性風味物質變化Fig. 5 Changes of volatile flavor compounds during fermentation

為進一步研究釀酒酵母對揮發性代謝物的影響，對試驗組和空白組發酵過程中酒醅揮發性代謝物組分進行PLS-DA 分析，如圖6a 所示。隨著發酵的進行，空白組與試驗組樣本點的距離逐漸增加，即糟醅中揮發性代謝物的組成差異逐漸增大。這說明試驗組與空白組兩個不同的微生物群落發生不同的代謝過程，隨著發酵的進行兩組的揮發性代謝物的差異進一步擴大。此外，基于VIP值計算試驗組與空白組揮發性代謝物的差異，結果如圖6b 所示，試驗組與空白組酒醅中乙醛、異戊醇、對甲苯酚、苯乙醇等18 種揮發性代謝物存在較大差異（VIP>1）。這些差異代謝物絕大多數是酯類和醇類，是濃香型白酒中重要的香氣物質[25]。這些酒醅中重要的揮發性風味物質含量及比例是決定酒醅質量的關鍵，在一定程度上會導致試驗組和空白組酒醅的品質差異。

圖6 發酵過程酒醅揮發性代謝物差異分析Fig. 6 Differential analysis of volatile metabolites in fermented grains during fermentation

2.4 差異代謝物與生物標志物的關系

酒醅中微生物主導揮發性風味物質的產生。為探究導致試驗組與空白組間差異代謝物產生的生物因素，構建差異代謝物與生物標志物的相關性網絡，如圖7 所示。在相關性網絡中，節點越大表示該節點有較高的度，即有更多的節點與之相連。對甲苯酚、乙醛、乙酸、糠醛、乙酸正丁酯具有較高的度，這些物質與較多的微生物存在顯著的相關性，這說明代謝物與多種微生物有關。曲霉屬與乙酸和糠醇呈現極強的正相關，曲霉屬能夠產生淀粉水解酶，產生的葡萄糖經糖酵解途徑后生成酸類和醇類[26]，這一結果可能與曲霉菌屬的水解糖化功能有關。醋酸桿菌屬和乳酸桿菌屬分別與異戊醇、癸酸乙酯、（+）-3-甲基-2-丁醇、乙酸正丁酯呈顯著負相關，這兩種微生物是濃香白酒酒醅中重要的產酸細菌。乳酸桿菌屬和醋酸菌屬產生的酸類物質一方面能夠作為白酒中重要的風味物質，另一方面也能夠作為其它風味物質的前體物[27-28]。然而，這些酸類物質在一定程度上也影響其它微生物的生長和代謝[29]。例如醋酸能夠抑制發酵過程中微生物的生長，并改變群落組成[30]。除產生酸類物質外，乳酸桿菌屬還能夠產生細菌屬以拮抗其它微生物[31]。因此，乳桿菌屬和醋酸桿菌屬不僅能夠直接參與風味物質代謝，還能通過產生酸類物質和細菌素間接影響微生物群落對風味物質的代謝。

圖7 差異揮發性代謝物與生物標志物的相關性Fig. 7 Correlation of differentially volatile metabolites with biomarkers

2.5 釀酒酵母對酒醅中微生物群落潛在功能的影響

為研究釀酒酵母對糟醅中微生物組代謝及功能的擾動，基于PICRUST2 對試驗組和空白組酒醅中微生物群落的功能基因進行預測。此外，對預測得到的試驗組與空白組基因進行負二項分布檢驗，如圖8 所示，共出現180 個上調基因和46 個下調基因。結果說明試驗組與空白組相比，180 個功能基因的豐度顯著增加，46 個功能基因豐度顯著降低。為進一步研究上調與下調基因的功能，基于KEGG 數據庫對180 個上調基因和46 個下調基因進行通路富集，以明確空白組與試驗組間的功能差異，如圖9 所示。在上調基因所富集的通路中，甲烷代謝，多環芳香烴降解，不同環境中的微生物代謝，芳香族化合物的降解，乙苯降解，C5-支鏈二元酸代謝，生物膜形成，氰基氨基酸代謝，吩嗪生物合成，硫代謝，碳代謝，硒化合物代謝，氨基苯甲酸酯降的富集結果顯著（P<0.05）。在下調基因富集的結果中，僅有苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、新生霉素生物合成、倍半萜和三萜生物合成、乙苯降解的富集結果顯著（P<0.05）。這些結果說明釀酒酵母能夠導致酒醅微生物群落13 條功能通路增強，而僅4 條功能通路減弱。這些增強的功能多數與物質的代謝有關，這將有利于微生物群落對底物的轉化，促進酒醅中代謝物的積累。

圖8 試驗組和空白組基因差異分析火山圖和基因數量柱狀圖Fig. 8 Volcano plot and histogram of gene number for gene difference analysis between experimental group and blank group

圖9 上調基因（a）與下調基因（b）KEGG 功能富集Fig. 9 Functional enrichment of up-regulated（a）genes and down-regulated genes（b）KEGG

3 結論

分別研究了釀酒酵母對酒醅微的生物群落組成、微生物生態網絡、揮發性代謝物、功能的影響。結果顯示，釀酒酵母導致酒醅發酵過程中微生物群落組成發生改變，其中5 種細菌和15 種真菌是區分試驗組與空白組的生物標志物。釀酒酵母的擾動效應增加了微生物生態網絡的復雜性，使得其在適宜條件下具有更強的生命活動，而降低了在惡劣條件下的穩定性。試驗組與空白組揮發性代謝物的組成差異隨發酵的進行逐漸增大，兩者間共有18 種差異代謝物。此外，絕大多數生物標志物與差異代謝物顯著相關?；诠δ茴A測發現釀酒酵母的擾動導致微生物群落共出現180 個上調基因和46 個下調基因，并且上調基因大多數與物質代謝相關。這些結果為優化酒醅發酵過程，為提高酒醅質量提供理論基礎。