壯骨強肌方對去勢大鼠骨密度及IL-17的影響

東智卓瑪 楊彬彬 林適 唐子佳 吳建軍 譚國志 楊昊霖 趙瑞 楊東升 鐘業霖 萬雷 黃宏興*

1.廣州中醫藥大學第三臨床醫學院,廣東 廣州 510405

2.廣州中醫藥大學第三附屬醫院,廣東 廣州 510378

骨質疏松癥(osteoporosis,OP)是一類骨量減少、骨微結構破壞,導致骨強度下降、脆性增加的全身性骨病,臨床常引發疼痛及骨折風險[1]。絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是中老年女性骨折的主要危險因素,其發病以雌激素缺乏引發骨重建失衡為主要機制。研究認為免疫狀態的變化亦參與了OP的發病機制,絕經后婦女慢性低水平炎癥狀態可能間接影響骨代謝促進PMOP的發生[2],其中Th17細胞作為輔助性T細胞亞型通過分泌細胞因子IL-17(interleukin-17)影響骨代謝[3-4]。OP抗骨質疏松藥物治療按照不同骨折風險程度推薦分層治療,目前西醫主要治療藥物包括雙膦酸鹽、地舒單抗、降鈣素及雌激素等[5],盡管對OP的機制研究已拓展到免疫學領域,免疫調節制劑能否運用于OP臨床治療還需要更多更深入的研究。然而,中醫整體觀指導下的辨證論治已將增強機體免疫實踐于OP的中醫治療中。

中醫認為脾為后天之本,氣血生化之源,脾虛水谷失司,則衛氣不充,抵御病邪能力下降,“四季脾旺不受邪”,脾氣充盛,則外邪不可犯、內疾不能傳,與今之免疫學相通[6]。在OP中醫病機轉化中,脾虛與OP發生發展密切相關。OP中醫歸為“骨痿”范疇,病機總體以肝腎陰虛、髓枯筋燥,脾腎陽虛、精虧失養,氣滯血瘀、脈絡瘀阻為主,證型主要分為肝腎陰虛型、脾腎陽虛型及氣滯血瘀型三類[7-8],治以補肝益腎、益氣健脾、活血化瘀為法。壯骨強肌方是廣州中醫藥大學第三附屬醫院黃宏興教授臨床經驗協定膏方[9],用于治療OP脾腎陽虛型,功效以補腎健脾、壯骨強肌、活血止痛為長。本研究擬觀察壯骨強肌方對去卵巢大鼠骨密度及IL-17的影響,探討骨與免疫在PMOP疾病中的關系,同時為壯骨強肌方的臨床運用補充實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:30只SPF級SD大鼠,6月齡,雌性,體重(343±20)g,由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供,實驗動物生產許可證號:SCXK(粵)2018-0034。飼養條件:恒定溫度(23±3)℃,相對濕度(55±5)%,12 h光/12 h暗光照循環,標準營養顆粒飼料,自由飲水飲食。本實驗經廣州中醫藥大學實驗動物倫理委員會審批通過,倫理審查號:20210922004。

1.1.2實驗藥物:壯骨強肌方組成藥物:黃芪30 g、丹參30 g、酒蓯蓉30 g、鹽杜仲25 g、山藥25 g、砂仁30 g、熟地黃25 g及鹿角膠20 g,實驗用濃縮制劑含生藥量1 g/mL,由廣州中醫藥大學第三附屬醫院藥劑科代煎;阿侖膦酸鈉片劑(國藥準字J20130085,批號U06983);戊巴比妥鈉(批號922L0314);注射用青霉素鈉(國藥準字H3702008)。

1.1.3主要儀器與試劑:雙能X線骨密度儀(美國Hologic,Discovery A型S/N 88761,h Hi-Res),Micro-CT掃描儀(德國SkyScan1276),脫水機(中國武漢俊杰電子有限公司,JJ-12J),包埋機(中國武漢俊杰電子有限公司,JB-P5),病理切片機(中國上海徠卡儀器有限公司,RM2016),正置光學顯微鏡(日本OLYMPUS,BX53),成像系統(日本尼康,Nikon DS-U3)。IL-17 antibody(Santa Cruz Biotechnology,sc-374218),IL-17A antibody(中國武漢三鷹生物技術有限公司,26163-1-AP),大鼠白細胞介素17(IL-17)ELISA檢測試劑盒(江萊生物,JL20879),二甲苯(國藥集團化學試劑有限公司,10023418),HE染液(武漢皮諾飛生物科技有限公司),蘇木素染液(武漢皮諾飛生物科技有限公司,P0064),中性樹膠(國藥集團化學試劑有限公司/10004160)。

1.2 方法

1.2.1造模與評估:SD大鼠按照隨機數字表分為Sham組(假手術組,n=9)和模型組(n=21)。術前禁食禁水12 h,3%戊巴比妥鈉經腹腔注射麻醉(40 mg/kg),麻醉成功后常規脫毛,術區消毒、鋪巾。大鼠經背側部雙切口逐層分離皮下組織與肌層,找到卵巢,OVX組予雙側輸卵管結扎并卵巢切除,Sham組僅切除卵巢周圍等體積脂肪組織,術后各組大鼠腹腔注射青霉素鈉(8萬/只),連續3 d預防感染。造模12周后,Sham組和OVX組各隨機抽取3只大鼠檢測腰椎骨密度以驗證造模,驗證造模大鼠從實驗剔除。

1.2.2分組與給藥:造模成功后,將模型組大鼠按照隨機數字表分為OVX組(模型對照組)、ZGQJ組(壯骨強肌方組)和Alen組(阿侖膦酸鈉組),每組6只。給藥劑量按照臨床人與大鼠體表面積換算公式計算(給藥量=臨床成人每日用藥量/60 kg×6.25)。臨床壯骨強肌方成人口服10～20 g,每日1～2次,故將20 g/d作為等效劑量,則ZGQJ組大鼠予以壯骨強肌方2.08 g/(kg·d)灌胃;阿侖膦酸鈉成人口服70 mg/周或10 mg/d,故將10 mg/d作為等效劑量,則Alen組大鼠予以阿侖膦酸鈉1.042 g/(kg·d)灌胃;OVX組和Sham組大鼠予以等體積生理鹽水灌胃。每周測量1次體重,各組連續給藥12周。

1.2.3樣本收集與處理:各組大鼠稱重后3%戊巴比妥鈉麻醉,采集腹主動脈血,血樣室溫靜置3 h后離心取上層血清,將血清分裝后液氮冷凍保存。取左下肢股骨及脛骨并4%多聚甲醛固定,取右下肢股骨及脛骨液氮冷凍保存,取脾臟稱重并4%多聚甲醛固定,以進行下一步檢測。

1.2.4DEXA檢測腰椎骨密度:取材前,各組大鼠麻醉后進行DEXA腰椎部位骨密度檢測,大鼠俯臥位。

1.2.5Micro-CT檢測脛骨骨微結構:固定于4%多聚甲醛的左下肢脛骨用Micro-CT掃描儀掃描,掃描參數設為:電壓70 kV,電流200 μA,分辨率10.14 μm,重建參數最大值0.058及最小值0.000 1。掃描獲得的CT數據運用NRecon軟件重建三維圖像,DataViewer旋轉圖像,CTvox合成3D圖像,CTAn分析骨組織微結構參數,包括骨體積分數(bone volume/tissue volume,BV/TV)、骨小梁數量(trabecular number,Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)及骨小梁分離度(trabecular separation,Tb.Sp)。

1.2.6HE染色觀察股骨骨組織病理變化:棄4%多聚甲醛,清除軟組織,用10% EDTA脫鈣液脫鈣,每2 d更換新脫鈣液,視5 mL注射器針頭能刺入骨組織為脫鈣完全,繼而石蠟包埋,切片。切片烤片處理后依次放入二甲苯、無水乙醇、75%酒精及純水中以脫蠟;放入蘇木素染液、純水、分化液、純水、返藍液及純水中以蘇木素染色;放入梯度酒精及伊紅染液以伊紅染色;放入無水乙醇、二甲苯以脫水,最后中性樹膠封片。各組股骨遠端切片用正置光學顯微鏡選取相同視野拍照,用Image J軟件在每個視野中隨機框取長寬相同的5個部位描畫骨小梁并計算面積(用標尺矯正)。

1.2.7血清炎癥因子IL-17表達水平:用ELISA法檢測血清IL-17表達水平,按試劑盒說明書進行操作。

1.2.8免疫熒光染色觀察脛骨IL-17表達水平:石蠟包埋切片依次進行脫蠟、微波抗原修復、血清封閉、一抗孵育、二抗孵育及DAYI染核。

1.2.9HE染色觀察脾臟病理變化:染色步驟同上述骨組織切片HE染色。

1.2.10免疫組化觀察脾臟IL-17表達水平:石蠟包埋切片依次進行脫蠟、檸檬酸修復液抗原修復、內源性酶阻斷、封閉、一抗孵育、二抗孵育及DAB顯色,同時進行蘇木素復染后封片。

1.3 統計學分析

數據均應用SPSS 22.0統計軟件分析處理,本實驗數據均為計量資料,其中符合正態分布用均數±標準差表示,不符合正態分布用中位數(四分位數間距)表示[M(P25～P75)]。兩樣本組間差異比較,符合正態分布用獨立樣本t檢驗,否則用Mann-Whitney U檢驗。多樣本組間差異比較,符合正態分布及方差齊性用單因素方差分析(one-way ANOVA),符合正態分布但不滿足方差齊性用Welch ANOVA,不符合正態分布則用Kruskal-Wallis非參數檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腰椎BMD比較

與Sham組比較,OVX組BMD降低(P<0.05),表明去卵巢骨質疏松模型構建成功。與OVX組比較,ZGQJ組與Alen組BMD增高(P<0.05)。與ZGQJ組比較,Alen組BMD較高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腰椎骨密度比較(g/cm2)

2.2 各組大鼠脛骨骨微結構

大鼠脛骨近端Micro-CT三維重建可見,對比Sham組,OVX組骨小梁數量減少,小梁間間隙增大,而ZGQJ組與Alen組明顯改善上述現象。定量分析驗證對比Sham組,OVX組BV/TV及Tb.N降低(P<0.05),Tb.Sp增高(P<0.05);對比OVX組,ZGQJ組與Alen組BV/TV、Tb.N及Tb.Th增高(P<0.05),Tb.Sp降低(P<0.05);ZGQJ組與Alen組相比,Alen組BV/TV及Tb.N更高(P<0.05),Tb.Sp更低(P<0.05)。見圖1。

圖1 Micro-CT檢測脛骨骨微結構

2.3 各組大鼠股骨HE染色

與Sham組比較,OVX組大鼠股骨骨小梁形態變細,網狀結構破壞,骨髓腔內脂肪空泡增多,骨小梁面積減少(P<0.05)。與OVX組比較,ZGQJ組與Alen組骨小梁增粗,網狀結構明顯,骨小梁面積增多(P<0.05),ZGQJ組骨髓腔內脂肪空泡明顯改善。與ZGQJ組比較,Alen組骨小梁面積較高(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠股骨HE染色

2.4 各組大鼠血清IL-17表達水平

與Sham組比較,OVX組大鼠血清IL-17表達增高(P<0.05)。與OVX組比較,ZGQJ組與Alen組血清IL-17水平較低(P<0.05)。ZGQJ組與Alen組對比無差別(P>0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠血清IL-17表達水平比較

2.5 各組大鼠脛骨IL-17免疫熒光染色

免疫熒光染色可見各組大鼠脛骨髓腔內組織細胞胞質均有不同程度IL-17表達。與Sham組比較,OVX組大鼠脛骨IL-17表達增高(P<0.05)。與OVX組比較,ZGQJ組大鼠脛骨IL-17表達降低(P<0.05),Alen組對比無差別(P>0.05)。ZGQJ組大鼠脛骨IL-17表達較Alen組低(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組大鼠脛骨IL-17免疫熒光染色

2.6 各組大鼠脾臟組織病理及脾臟指數

Sham組大鼠脾臟紅髓與白髓交界明顯,脾小體結構清晰,淋巴小結與動脈周圍淋巴鞘深淺分明,大抵呈圓形。與Sham組比較,OVX組與Alen組大鼠脾臟紅髓與白髓交界不清,脾小體形態不規則,呈條索狀。與OVX組比較,ZGQJ組大鼠脾臟脾小體形態規則,交界明顯,在病理結構上明顯改善。

與Sham組比較,OVX組大鼠脾臟指數下降(P<0.05)。與OVX組比較,ZGQJ組大鼠脾臟指數提高(P<0.05)。ZGQJ組與Alen組無差別(P>0.05)。見圖5。

圖5 各組大鼠脾臟組織HE染色

2.7 各組大鼠脾臟IL-17表達水平

各組大鼠脾臟均有不同程度IL-17表達。在Sham組呈淡黃色低表達,與Sham組相比,OVX組呈棕褐色高表達(P<0.05)。與OVX組比較,ZGQJ組呈黃棕色低表達(P<0.05),Alen組對比無差別(P>0.05)。ZGQJ組大鼠脾臟IL-17表達較Alen組低(P<0.05)。見圖6。

圖6 各組大鼠脾臟組織IL-17免疫組化染色

3 討論

腎為先天之本,主骨,生髓,促進人體生長發育及生殖功能?！妒備洝分醒?“骨屬于腎,腎若虛損,則髓竭骨枯”,說明腎虛是OP發生發展的根本?！端貑枴ど瞎盘煺嬲摗分醒?“女子四七筋骨堅……七七任脈虛,太沖脈衰少,天癸竭”,腎氣充盛則筋骨強健,隨著年齡增長腎氣漸趨衰竭至天癸竭,女性絕經后精虧骨髓失養引發PMOP。脾作為后天之本,與OP的發生發展亦密切相關[10-11]?！镀⑽刚摗分醒?“脾胃虛弱……五臟之氣不生。脾病則下流乘腎,土克水,則骨乏無力,是為骨蝕,令人骨髓空虛”,脾主運化以生氣血,脾氣充盛則水谷精微運化有所主,氣血生化有源則五臟得以濡養,腎精得以滋養則骨強,脾氣虛弱則運化失司,氣血生化乏源則五臟失養,腎精失充則骨枯?！秱摗て矫}法》中言:“寸口脈緩而遲,緩則陽氣長……遲則陰氣盛,骨髓生”,胃合衛氣,衛氣調和充盛于外則寸口脈緩,脾合營氣,營充血滿于內則脈遲,脾胃強健,營衛調和,陰陽相濟,則骨髓生長?！芭游迤?陽明脈衰,面始焦,發始墮”也能說明脾胃虛弱腎精失充在PMOP發生發展中的重要作用。因此OP的治療不能只著眼于補腎填精,補腎與健脾并重才是根本。本研究之壯骨強肌方以補腎健脾、壯骨強肌、活血止痛為長,研究結果顯示與OVX組比較,ZGQJ組腰椎BMD增高(P<0.05),脛骨BV/TV、Tb.N及Tb.Th增高(P<0.05)且Tb.Sp降低(P<0.05),股骨HE染色骨小梁面積增多(P<0.05)且髓腔內脂肪空泡改善,表明壯骨強肌方具有增強去卵巢大鼠腰椎骨密度、改善脛骨及股骨骨小梁結構的作用。

雌激素下降和骨骼對機械刺激產生的適應性反應減弱是PMOP骨丟失的主要機制[12],隨著對PMOP發病機制的深入研究,許多研究表明免疫系統與骨骼系統之間存在復雜的聯系,免疫細胞通過分泌各種炎性介質直接或間接的調節骨細胞、成骨細胞及破骨細胞的活動,反之,不同類型的骨細胞亦能影響免疫細胞的活性[13-15],如巨噬細胞的促炎表型M1型可促進高活性氧環境的形成和破骨細胞因子TNF-a和IL-1β的釋放以促進破骨細胞的發生,而抗炎表型M2型分泌TGF-β和IL-10等抗炎細胞因子發揮抗炎和免疫調節作用[16-18],雌激素缺乏可使M1型極化增強而M2型極化受損[19],PMOP患者中存在TNF-α和IL-1β因子水平增加的表型[2];樹突狀細胞可表達RANKL,產生促炎細胞因子TNF-α和IL-1等以促進形成[20],還可以直接分化為破骨細胞[21];中性粒細胞的過度活躍利于破骨細胞骨吸收,而雌激素可抑制中性粒細胞過度活化[22];活化的T細胞通過在PMOP中強表達RANKL促進破骨細胞的發生[23];B細胞可產生RANKL以刺激破骨細胞的形成[24]。然而對免疫器官與骨代謝的研究較少,因此,本研究通過去卵巢大鼠脾臟HE染色觀察雌激素缺乏對最大的免疫器官脾的影響,研究結果顯示與Sham組比較,OVX組大鼠脾臟組織出現紅髓與白髓交界不清、脾小體形態不規則病理改變,脾臟指數下降(P<0.05)。在諸多免疫細胞中,CD4+T輔助(Th)細胞在骨重塑的調節中發揮了關鍵作用,根據細胞因子表達譜的不同分為Th1、Th2、Th17和Treg細胞亞群。Th1細胞可通過產生TNF-α促進破骨,還可通過產生IFN-γ抑制破骨,具有雙重作用;Th2細胞通過產生Il-4、IL-5和IL-13發揮抗炎及保護骨骼的作用;Treg細胞通過減少破骨細胞數量發揮骨保護作用[25-26]。Th17細胞作為輔助性T細胞亞型中促破骨細胞亞型,其在骨重塑過程中的作用主要通過其分泌的特征性促炎因子IL-17產生。主流的觀點認為IL-17通過上調破骨細胞前體上的RANK受體表達從而促進破骨細胞分化[27],阻斷IL-17通路對OVX小鼠骨丟失具有保護作用[28],條件性敲除破骨前體的IL-17A受體表現骨保護作用且破骨細胞形成減少[3],雌激素缺乏時Th17/Treg平衡被破壞[25],Th17細胞本身也可通過表達RANKL直接激活破骨細胞前體[29-31]。因此,本研究通過檢測去卵巢大鼠血清、脛骨及脾臟IL-17表達水平,驗證雌激素缺乏對IL-17表達的影響,研究結果顯示與Sham組比較,OVX組大鼠血清、脛骨及脾臟IL-17表達增高(P<0.05),與既往研究結果一致。

中醫認為脾為后天之本,氣血生化之源,《景岳全書》中言:“五臟中皆有脾氣”,脾氣充盛,水谷精微經脾輸布全身,五臟得以濡養而各司其職,衛氣得以充養而抵御外邪有力,外邪不可犯、內疾不能傳則身體強健,與今之免疫學相通。因此,本研究通過中藥灌胃后去卵巢大鼠血清、脛骨及脾臟IL-17表達水平檢測,觀察壯骨強肌方對去卵巢大鼠IL-17免疫的影響,研究結果顯示與OVX組比較,ZGQJ組大鼠血清、脛骨及脾臟IL-17表達降低(P<0.05)。同時,ZGQJ組大鼠脾臟組織病理結構明顯改善,脾臟指數提高(P<0.05),表明壯骨強肌方具有調節去卵巢大鼠IL-17表達及改善脾臟免疫功能作用。

綜上所述,去卵巢大鼠存在骨密度降低及骨小梁微結構破壞等骨重建失衡改變的同時,免疫系統也受到不同程度影響。中藥壯骨強肌方具有提高去卵巢大鼠腰椎骨密度,改善脛骨及股骨骨小梁結構,降低IL-17表達,改善脾臟免疫功能作用,為其臨床運用提供了一定科學依據。