變異型高致病性鵝源禽呼腸孤病毒的分離和鑒定

錢金涵,朱亭帆,王 強,馬陳淑,秦愛建,3,金文杰,3,4

(1. 揚州大學獸醫學院,江蘇 揚州 225009;2.揚州大學江蘇省動物預防醫學重點實驗室,江蘇 揚州 225009;3. 江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心,江蘇 揚州 225009;4.揚州大學動物疾病檢測與技術服務中心,江蘇 揚州 225009)

禽呼腸孤病毒(Avian reovirus,ARV)是一種分節段的雙股RNA病毒,屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)正呼腸孤病毒屬(Orthoreovirus)[1]。ARV是引起全世界家禽疾病中最為重要的病原之一,能感染包括雞、鴨、鵝在內的多種禽類[2],ARV感染在世界各地均有發生,我國自20世紀80年代中期以來已有多個省市發現本病,嚴重影響了養禽業的發展。ARV既能引起宿主產生疾病,又能引起宿主免疫抑制,加劇其他病原的感染,既可水平傳播也能垂直傳播[3,4],對全球家禽業造成重大經濟損失。ARV與雞的病毒性關節炎、發育遲緩綜合征和腱鞘炎有關[2]。匈牙利的一項研究表明,鵝感染呼腸孤病毒表現為運動障礙和跛足,并伴有脾炎、肝炎、心外膜炎、關節炎和腱鞘炎[5]。綜上所述,ARV感染引起的疾病發病率不斷上升且出現了多樣化的臨床疾病形式,表明ARV的影響越來越大,給養禽業造成了嚴重的損失。

ARV基因組可按節段大小分為大(L1-L3)、中(M1-M3)和小(S1-S4)三類,它們至少編碼8種結構蛋白和4種非結構蛋白[1]。其中S1基因編碼的σC蛋白是最小的結構蛋白,為外衣殼的次要組成成分。σC蛋白具有病毒附著[6]和誘導細胞凋亡[7]的作用。ARV誘導的細胞融合已被證明是由σC蛋白介導的,細胞融合可能在病毒發病機制中起重要作用[8]。σC蛋白攜帶有特異性中和反應的抗原,可誘導細胞產生病毒型特異性的中和抗體[6,9]。ARV基因組中變異最大的基因是σC基因[10],可以利用σC基因對ARV進行分類[11]。同時,σC蛋白也是ARV亞單位疫苗的主要研究對象。

本試驗從江蘇省揚州市江都區某鵝場的病死鵝肝臟和脾臟中分離得到1株鵝源ARV,對該分離毒株進行遺傳進化分析,了解ARV的變異趨勢和流行情況,以期為該地區ARV的防控提供分子流行病學依據。

1 材料與方法

1.1 病料樣品采集和處理 2020年9月,江蘇省揚州市江都區某鵝場連續數日發生鵝死亡,對病死鵝進行剖檢觀察大體病變。采集病死鵝的肝臟和脾臟,將肝臟和脾臟組織與磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffered saline,PBS)按1∶3混合,研磨破碎,4 ℃、10 000 r/min離心10 min,吸取上清過0.22 μm濾器過濾除菌后備用。

1.2 主要試劑 GreenTaqMix、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、RNA提取試劑盒和工程菌株DH5α,均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;T4連接酶、載體pGEM-T Easy和PrimeScriptTMⅡ 1st Stard cDNA Synthesis Kit,均購自寶日醫生物技術(北京)有限公司;QIAquick Gel Extraction Kit,購自QIAGEN公司;AxyPrep質粒DNA小量試劑盒,購自AXYGEN公司;DMEM培養基和胎牛血清,均購自Gibco公司。

1.3 主要儀器 超凈操作工作臺、渦旋混勻儀和高速冷凍離心機,Eppendorf公司產品;96孔PCR擴增儀,杭州博日科技股份有限公司產品;紫外凝膠成像系統,DNR成像系統公司產品。

1.4 實驗動物 無特定病原體(Specific pathogen free,SPF)級雞胚,10日齡,購自江蘇勃林格殷格翰維通生物技術有限公司[生產許可證號:SCXK(蘇)2022—0002]。雛鵝,11日齡,購自揚州佳麗鵝業。

1.5 反轉錄聚合酶鏈反應(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測 取500 μL組織研磨液上清按RNA提取試劑盒說明書提取RNA,反轉錄得到互補脫氧核糖核酸(Complementary deoxyribo nucleic acid,cDNA),參照GenBank中ARV保守序列設計1對引物(表1),由南京擎科生物科技有限公司合成。聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction,PCR)反應體系:GreenTaqMix 12.5 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,模板cDNA 2 μL,ddH2O 8.5 μL。PCR反應程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s,58 ℃ 15 s,72 ℃ 1 min,30個循環;72 ℃ 5 min,4 ℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR產物,將陽性條帶送南京擎科生物科技有限公司測序驗證。

表1 ARV檢測引物

1.6 病毒分離培養 將組織研磨液上清加入青霉素-鏈霉素混合液,于37 ℃孵育30 min,12 000 r/min離心10 min,取上清經0.22 μm濾器過濾。將無菌的濾液經尿囊腔途徑接種10日齡SPF級雞胚,每胚接種0.2 mL,棄去24 h內死亡胚,連續觀察8 d。收獲尿囊液經細菌檢測后通過尿囊腔途徑再接種10日齡SPF級雞胚,連續傳代3次。將收獲的尿囊液作為種毒(命名為ARV-JSJD-2020株),分裝保存于-80 ℃備用。

將種毒尿囊液接種至Vero細胞,在37 ℃、5%CO2培養箱中孵育2 h后棄去尿囊液,用含2%胎牛血清的DMEM培養基維持培養,待120 h后收集病毒,反復凍融5次,5 000 r/min離心10 min取上清,標記為第1代細胞病毒液。重復上述操作,將病毒在Vero細胞上盲傳直至出現細胞病變。

1.7 病毒血凝活性測定 配置體積分數為1%的雞紅細胞懸液,在96孔板每孔均加入50 μL PBS,于左側第1孔加入50 μL種毒尿囊液,依次倍比稀釋至第11孔,吸出50 μL棄去,最后一孔作為對照。向每孔中均加入50 μL 1%雞紅細胞懸液,37 ℃靜置15 min后觀察結果。

1.8 病毒雞胚半數致死量(Median embryo lethal dose,ELD50)測定 將ARV-JSJD-2020株病毒的種毒尿囊液用PBS緩沖液進行10倍梯度稀釋,取10-1～10-8每個稀釋度通過尿囊腔膜接種10日齡SPF級雞胚3枚,接種量為每胚0.2 mL。每天照蛋觀察,記錄死亡情況并根據Karber法計算ELD50。

1.9 動物回歸試驗 選擇11日齡的雛鵝,試驗組頸部皮下注射種毒尿囊液0.2 mL,對照組頸部皮下注射無菌PBS 0.2 mL,每日觀察雛鵝情況。若出現死亡,剖檢觀察發病情況,并用4%甲醛固定臟器制作病理切片,將肝臟和脾臟組織研磨液上清接種雞胚。

1.10 病毒σC基因分析

1.10.1σC基因PCR擴增 參照GenBank上已發表的ARVσC基因序列,設計1對特異性引物(表2),由南京擎科生物科技有限公司合成。PCR反應體系:2×Phanta Max Buffer 25 μL,Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL,dNTP Mix 1 μL,上游引物2 μL,下游引物2 μL,模板cDNA 1 ng,補足ddH2O至50 μL。PCR反應程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s,50 ℃ 15 s,72 ℃ 26 s,30個循環;72 ℃ 5 min,4 ℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物,將PCR產物經膠回收試劑盒回收純化后與載體pGEM-T Easy連接,轉化至DH5α感受態細胞,提取質粒送至南京擎科生物科技有限公司進行測序分析。

表2 ARV σC基因檢測引物

1.10.2σC基因序列分析 將ARV-JSJD-2020株的σC基因序列與NCBI上發表的ARVσC基因序列(表3)進行比較,運用MegAlign軟件進行核苷酸序列和氨基酸序列分析,并使用MEGA 7軟件繪制遺傳進化樹。

表3 ARV參考株信息

2 結果

2.1 病死鵝剖檢觀察 剖檢可見病死鵝的肝臟和脾臟腫大出血,有心包積液,腸道出現粘連,胰腺出血,腺胃黏膜充血出血,喉頭有黏液樣滲出。

2.2 RT-PCR檢測 如圖1所示,疑似病料用RT-PCR可擴增出約585 bp的特異性條帶,與預期大小相符。

圖1 疑似病料的RT-PCR檢測

2.3 病毒分離培養 接種病死鵝肝臟和脾臟研磨液上清的大多數雞胚在24～96 h內死亡,死亡雞胚尿囊液清澈,細菌檢驗結果為陰性,死亡雞胚的胚體充血出血呈鮮紅或紫紅色,胚體發育不良,剖檢肝臟紅腫出血。將收獲的種毒尿囊液接種Vero細胞,接種120 h后,未見細胞病變,收獲細胞懸液,反復凍融后繼續在Vero細胞上傳代,至第5代時出現細胞病變,細胞界限模糊,皺縮死亡,出現拉絲現象,折光性改變(圖2)。

圖2 病毒的分離培養(100×)

2.4 病毒血凝活性測定 ARV-JSJD-2020株病毒對1%雞紅細胞無肉眼可見的凝集作用。

2.5 病毒ELD50測定 尿囊液以10-1和10-2稀釋度接種雞胚各死亡3枚,10-3、10-4和10-6稀釋度接種雞胚各死亡1枚,10-5稀釋度接種雞胚死亡2枚,10-7和10-8稀釋度接種雞胚均未死亡。根據Karber法計算,病毒ELD50為10-4.166/0.2 mL。

2.6 動物回歸試驗 試驗組接種種毒尿囊液的雛鵝24 h后即出現死亡現象,剖檢可見其肝臟和脾臟出血。組織病理學觀察顯示,肝臟出現局灶性壞死,壞死灶內出現淋巴細胞浸潤(圖3)。將試驗組肝臟和脾臟研磨液上清接種雞胚,雞胚在24～96 h內死亡。

圖3 肝臟組織病理學觀察(H.E.染色,100×)

2.7σC基因PCR擴增 如圖4所示,σC部分基因擴增結果與預期大小相符,測序結果證實為ARVσC基因。

圖4 ARV-JSJD-2020 σC基因片段的PCR擴增

2.8σC基因序列分析 將ARV-JSJD-2020與GenBank上參考毒株進行比對,分析σC基因遺傳進化差異,結果如圖5和圖6所示,ARV-JSJD-2020與GenBank上參考毒株的核苷酸同源性為38.5%～98.7%,氨基酸同源性為28.0%～98.1%。ARV-JSJD-2020與水禽源ARV的核苷酸同源性為49.6%～98.7%,而與雞源ARV的核苷酸同源性只有38.5%～41.6%。ARV-JSJD-2020與水禽源ARV的氨基酸同源性為38.2%～98.1%,而與雞源ARV的氨基酸同源性僅為28.0%～31.1%。為了進一步分析ARV-JSJD-2020與其他毒株在遺傳進化上的關系,建立遺傳進化樹,結果如圖7所示,通過對σC基因進行基因分析,可將ARV劃分成2個大群(GI和GII),GI群屬于水禽源ARV,GII群屬于雞源ARV,分離得到的ARV-JSJD-2020屬于GI群,即為水禽源ARV。其中S1133、減毒S1133和1733均為疫苗株,但它們均為雞源ARV,與ARV-JSJD-2020屬于不同分支,親緣性較遠。番鴨呼腸孤病毒CA是市售的弱毒活疫苗株,與ARV-JSJD-2020雖然同屬水禽源ARV,但親緣關系較遠。GI群水禽源ARV又可以分為2個亞群,ARV-JSJD-2020、YY10G和03G這3株鵝源呼腸孤病毒與鴨源呼腸孤病毒屬同一亞群,而在匈牙利分離得到的D34-99和D20-99、在法國分離得到的89330以及在我國分離得到的GRV-GD2020這4株鵝源呼腸孤病毒與番鴨源呼腸孤病毒屬同一亞群。

圖5 σC基因核苷酸序列同源性比對

圖6 σC基因氨基酸序列同源性比對

圖7 σC基因的遺傳進化樹

3 討論

ARV感染在世界各地均有發生,美洲[12]、歐洲[13]、亞洲[14]、非洲[15]和大洋洲[16]這五大洲無一例外,在肉雞、蛋雞、火雞、鴨、鵝、鴿子、鸚鵡和野生鳥類等上均檢測分離到ARV,ARV影響范圍波及全世界的各種禽類物種。自20世紀80年代中期以來,我國已有多個省市發現本病,嚴重影響了養禽業的發展。1985年,王錫堃等[17]發現了我國第1例雞病毒性關節炎病例;2001年,吳寶成等[18]從患病番鴨中分離出7株呼腸孤病毒株,是我國首次分離出的鴨呼腸孤病毒(Duck reovirus,DRV)毒株;2002年,王光鋒等[19]首次從表現為出血性壞死的病鵝肝臟中分離得到鵝呼腸孤病毒(Goose reovirus,GRV)毒株。近年來,ARV表現出較高的遺傳多樣性且其致病性呈上升趨勢[20],出現了不斷多樣化的臨床疾病形式,表明ARV的影響越來越大,給養禽業造成了嚴重的損失。

本試驗從江蘇省揚州市江都區某鵝場進行采樣,通過組織病料PCR檢測、雞胚分離、細胞培養等方法分離得到1株鵝源ARV,將該分離株命名為ARV-JSJD-2020。ARV-JSJD-2020造成的臨床病變與其他毒株相似,肝臟組織病理學表現與波蘭鵝群中分離得到的GRV類似[21],但其雞胚致死率和雛鵝發病情況相對于其他毒株較高且致死時間較快,并且對成年鵝有致死性,有可能是1株變異型強毒株。

ARV感染造成的家禽飼養業的重大經濟損失,強調了對新出現的ARV分離株進行患病率、遺傳特征和致病性進化等研究的重要性[22]。王丹等[23]對ARV所有基因節段構建遺傳進化樹進行分析,發現除了M2基因外,雞源毒株和水禽源毒株分別形成2個獨立的分支。本試驗對分離株ARV-JSJD-2020的σC基因進行測序分析,并與GenBank中其他ARV毒株進行同源性和遺傳進化分析,結果顯示,ARV-JSJD-2020屬于水禽源分支。而目前廣泛使用的滅活疫苗毒株S1133和1733以及減毒活疫苗毒株減毒S1133[24]均屬于雞源ARV,與水禽源ARV不屬于同一分支。番鴨呼腸孤病毒毒株CA是已經市售的弱毒活疫苗,與ARV-JSJD-2020雖然同屬水禽源ARV,但親緣關系較遠。根據基因進化樹可以發現,從鵝源分離得到的ARV,部分與鴨呼腸孤病毒屬同一亞群,而另一部分與番鴨呼腸孤同屬另一亞群,2個亞群之間親緣性不高,這給防治水禽ARV帶來了巨大的挑戰。本試驗分離得到的ARV-JSJD-2020可以為后續鵝源ARV的防控和疫苗的研發提供參考依據。