心肌肌鈣蛋白I檢測結果假陰性病例報道并文獻復習

劉路遙,袁文濤,江 波,任書文,何成山

上海中醫藥大學附屬第七人民醫院醫學檢驗科,上海 200137

心肌肌鈣蛋白I(cTnI)在心肌損傷時可迅速釋放至外周循環中,cTnI因其心臟特異性好,靈敏度高,檢測窗口期長,已成為臨床上診斷心肌損傷的首選血清學標志物[1]。cTnI的臨床檢測基于夾心抗體免疫法,檢測/捕獲抗體與cTnI不同抗原表位相結合,通過檢測抗體上酶標基團的化學發光信號,計算cTnI水平[2]。近年來隨著免疫檢測和單克隆抗體技術的提升,溶血、黃疸、脂血、抗凝劑等分析前因素的影響已變得微乎其微[3],相對而言一些內源性自身抗體對免疫學檢測的干擾作用更加令人關注[4-5]。本研究報道了1例因免疫性心肌肌鈣蛋白I自身抗體(cTnIAAb)導致cTnI與其他心肌損傷標志物檢測結果嚴重不相符的臨床案例,現報道如下。

1 病例資料

1.1一般資料 患者,女,76歲,主訴右下肢隱痛3 d,加重1 d。入院查體:右下肢膝關節以下皮膚青紫,活動受限。輔助檢查:(1)右下肢血管超聲。右側股總動脈、股深動脈、股淺動脈、腘動脈栓塞,右側下肢深靜脈血流通暢。(2)CT檢查。主動脈粥樣硬化,心臟增大,心包少量積液,下側雙肢動脈粥樣硬化,右側股動脈和腘動脈節段性閉塞。(3)心電圖檢查。心房顫動,左室高電壓,T波V4、V5、V6倒置,Q-T間期延長。(4)心臟超聲檢查。全心擴大,室間隔增厚,二尖瓣,主動脈瓣輕度反流。(5)實驗室檢查。cTnI 0.023 ng/mL(正常參考值<0.026 ng/mL),肌酸激酶同工酶(CM-MB)113 ng/mL(正常參考值<5 ng/mL),肌紅蛋白(MYO)648 ng/mL(正常參考值0～106 ng/mL),B型鈉尿肽(BNP)282 pg/mL(正常參考值10～100 pg/mL),乳酸脫氫酶(LDH)273 U/L(正常參考值125～220 U/L),肌酸激酶(CK)1 241 U/L(正常參考值50～310 U/L)。入院診斷:右下肢動脈栓塞,主動脈及雙下肢動脈硬化,心房顫動,高血壓。

1.2病例分析 患者年齡較大,全身性疾病較多,心電圖顯示心律失常,心房纖顫,形成的血栓經血液循環造成下肢動脈急性栓塞。心臟超聲檢查顯示全心增大,室間隔增厚,BNP水平大幅度升高,提示患者出現較為嚴重的心力衰竭表現。左室高電壓,T波V4、V5、V6倒置,提示心肌出現缺血性改變。心肌損傷標志物CK、CM-MB、MYO水平均大幅度升高,但cTnI為0.023 ng/mL(正常參考值<0.026 ng/mL)提示檢測結果正常?；颊咝穆墒С?心功能較差導致代償性全心增大,心肌長期缺血,產生心肌損傷,造成心肌損傷的血清學標志物水平顯著升高,而cTnI的檢測結果卻未見明顯異常。對這一異?，F象進行分析,筆者猜想cTnI檢測結果出現了假陰性。

1.3cTnI檢測異常結果的分析

1.3.1cTnI檢驗結果復檢 自檢Abbott Architect i2000全自動免疫分析儀狀態和室內質控,確認無誤后對該樣本進行復測,復測結果cTnI為0.025 ng/mL,與原結果基本一致。為了驗證是否為檢測系統的因素,筆者另使用Roche Cobas e602和Sunlant SLP-001檢測系統及相關配套試劑對樣本的cTnI水平進行復測,檢測結果均顯示為陰性。鑒于3種不同cTnI檢測系統對于此患者血清樣本的cTnI檢測結果均為陰性,筆者考慮是否為一種內源性自身抗體干擾了cTnI的免疫學檢測,造成cTnI的檢測結果異常。

1.3.2檢測抗核抗體譜免疫球蛋白G(IgG)水平 采用Sunlant公司抗核抗體譜IgG檢測試劑盒,檢測該血清樣本的抗核抗體,結果顯示:Ro-52、SS-A/Ro、PO、線粒體抗體(M2)、組蛋白、雙鏈DNA(dsDNA)、Jo-1、核小體、nRNP/Sm、Sm、PM-Scl、類風濕因子(RF)為陰性,SSB(30.68 RU/mL)、Scl-70(34.53 RU/mL)、CENPB(451.29 RU/mL)呈弱陽性(以上各項參考值≤20.00 RU/mL),提示該患者可能存在系統性紅斑狼瘡、彌漫性系統性硬化等一系列自身免疫性疾病,但病程記錄中未見?；诨颊叽嬖谧陨砻庖咝约膊?外周循環中含有多種自身免疫性抗體,證實了筆者的猜想,可能是某種內源性的自身抗體干擾了cTnI的檢測造成假陰性結果,最有可能的為cTnIAAb。

1.3.3采用前期自建的一種基于蛋白芯片的cTnIAAb檢測方法,以天然cTnI-肌鈣蛋白C(TnC)和TnC為抗原,辣根過氧化物酶-鼠抗人IgG作為二抗[6],檢測該樣本血清cTnIAAb。結果顯示cTnI-TnC列光圈明亮飽滿,檢測信號值達8 004.1 AU/mL,而TnC列僅為405.3 AU/mL,提示該患者血清樣本cTnIAAb強陽性,見圖1。

注：第1～3列點樣順序:鼠源性1-IRP抗體、cTnI-TnC、TnC。

1.3.4cTnIAAb對cTnI檢測的影響 為了明確該患者血清樣本中的cTnIAAb對cTnI檢測的負性干擾程度,筆者在cTnIAAb陽性和陰性基質血清樣本(cTnI和cTnIAAb均為陰性)中加入一定體積終水平為200 ng/mL cTnI-TnC的天然抗原,置于37 ℃水浴箱孵育30 min后經Architect i2000全自動免疫分析儀上機測定,cTnI測定值分為cTnI回收濃度和理論濃度,并計算cTnI回收率,cTnI回收率=(cTnI回收濃度-基礎cTnI值)/cTnI理論濃度(因樣本基礎cTnI<0.026 ng/mL可忽略不計)。結果顯示加入0.25 μL、0.50 μL、1.00 μL、1.50 μL、2.00 μL、2.50 μL 200 ng/mL的cTnI-TnC天然抗原后,cTnIAAb陽性樣本中cTnI回收率分別為19.37%、25.36%、32.18%、40.78%、53.28%、68.15%,cTnI回收率隨著加入cTnI-TnC抗原量的增多而升高,呈正相關,具有良好的線性關系(R2=0.98,P=0.001),見圖2。

注：cTnIAAb陽性患者血清的cTnI回收率,Y=20.73×X+13.03,R2=0.98。

2 文獻復習

以“cTnI免疫學檢測干擾”和“cTnIAAb”為關鍵詞對知網和SCI數據庫從1995年至2023年發表的文獻進行檢索。共檢索到文獻35篇,排除15篇,最終保留文獻20篇。結合病歷分析和文獻復習,本文主要從臨床上干擾cTnI免疫檢測的角度出發,重點敘述cTnIAAb的研究進展,總結cTnIAAb干擾cTnI免疫檢測的成因和機制等研究現狀。

2.1cTnIAAb的研究進展 外周循環中的cTnI抗原會促進機體的自身免疫系統產生特異性的cTnIAAb[7]。1996年BOHNER等[8]首次在1例接受冠狀動脈旁路手術的患者體內發現了一種可與cTnI結合的IgG,造成該患者cTnI檢測結果正常而其他心肌損傷血清標志物水平大幅度上升,后續ERIKSSON等[9]研究證實了該IgG為造成cTnI檢測結果異常的主要原因,并首次提出了cTnIAAb的概念。cTnIAAb廣泛存在于缺血性心肌病、擴張性心肌病等心肌類疾病中[10-11],cTnIAAb與心肌損傷后的持續性炎癥反應、心臟功能受損、心室重構和心力衰竭等密切相關[12-14]。

2.2cTnIAAb干擾cTnI免疫檢測機制 在cTnI的免疫學檢測中,肽鏈的N端(a.a.r 1-30)和C端(a.a.r 30-110)抗原氨基酸殘基易被蛋白酶水解,中心穩定區域(a.a.r 30-110)的氨基酸受TnC的保護[15],由于其化學性質較為穩定被廣泛作為特異性cTnI檢測抗體位點,在后續的研究中發現即使針對中心穩定區域設計的特異性檢測抗體依然會受到多種因素的干擾,其中最主要的就是cTnIAAb[16-17]。cTnIAAb可被特異性的cTnI捕獲或檢測抗體競爭結合循環中的cTnI抗原,造成cTnI檢測結果失真[18]。有研究顯示,cTnIAAb與cTnI肽鏈的a.a.r 65-74、83-93、86-90、104-119、117-126和130-145抗原表位相結合[16],這些抗原表位主要位于cTnI肽鏈的中心穩定區域并向羧基端延伸,其中受cTnIAAb嚴重影響的中心穩定區域與大部分商業化cTnI試劑盒的捕獲/檢測抗體結合位點相似,這也證實了大部分cTnI檢測試劑都無法擺脫cTnIAAb干擾的原因。

3 討 論

本研究中患者心功能不全,全心代償性增大伴嚴重心力衰竭,心肌存在長期缺血性損傷,cTnI持續釋放至外周循環中?；诨颊叽嬖谧陨砻庖咝约膊∈?長期微量的cTnI抗原會促進機體的自身免疫系統產生cTnIAAb。血清cTnI檢測結果為陰性,其他心肌損傷標志物如:CK、CM-MB、MYO水平均大幅度升高,結合臨床資料筆者猜想cTnI異常檢測結果可能是cTnIAAb造成的。筆者首先使用原檢測系統對樣本cTnI進行了復檢,又采用了Roche和Sanlant兩種不同cTnI檢測系統進行cTnI復測,結果均為陰性。不同cTnI檢測系統中針對cTnI抗原設計的特異性抗體的抗原表位存在一定的差異,基于國際臨床化學聯合會公布的全球知名的cTnI檢測系統特異性抗體抗原表位(檢測/捕獲抗體)[19],其中Abbott Architect cTnI(a.a.r 24-41,a.a.r 86-91,a.a.r 42-49);Roche cobas e601/602 cTnI(a.a.r 86-91,a.a.r 22-44),筆者猜想可能是由于樣本中的cTnIAAb封閉cTnI上述區段的抗原表位,使得檢測/捕獲抗體無法結合cTnI,造成cTnI檢測結果呈假陰性。

血液中的cTnI存在形式復雜,單體cTnI易被蛋白酶水解,大部分以cTnI-TnC復合物的形式存在[20]。因此筆者模擬cTnI在外周循環中的主要存在形式,采用cTnI-TnC天然抗原點樣芯片,自建了一種全新的cTnIAAb檢測方法[1],結果顯示該患者血清cTnIAAb為強陽性,證實了筆者的猜想。為進一步研究cTnIAAb對cTnI檢測系統的負性干擾程度,筆者將cTnI-TnC抗原加入cTnIAAb陽性患者血清和cTnIAAb陰性介質血清中,進行cTnI回收實驗,結果顯示cTnIAAb陽性血清中加入2.5 μL的200 ng/mL cTnI-TnC天然抗原后,cTnI回收率為19.37%,即使加入2.5 μL的200 ng/mL cTnI-TnC天然抗原時,cTnI回收率也僅為68.15%。cTnI回收率隨著加入cTnI-TnC天然抗原量的增多而增加,呈正相關,具有良好的線性關系(R2=0.98,P=0.001),研究結果證實該樣本血清中的cTnIAAb可嚴重干擾Architect i2000對cTnI的檢測,導致cTnI檢測結果出現假陰性,產生cTnI結果與其他心肌損傷標志物嚴重不相符的現象。

綜上所述,cTnIAAb可與cTnI特異性抗體競爭性結合cTnI抗原表位,從而導致cTnI檢測結果嚴重失真,產生cTnI結果與心肌損傷標志物嚴重不符的現象。以上提示在臨床工作中遇到此類現象時,應當首先自檢當日質控及儀器狀態以保證檢驗結果的準確性,積極與臨床醫生溝通了解患者的臨床表征與cTnI檢測結果是否相符,共同尋找cTnI檢測結果異常的原因。