去卵巢骨質疏松大鼠腹腔注射白藜蘆醇及雌二醇的效果評價

黃燕 李鈺娜 宋麗華 牛曉紅 冀菁荃 李卿

1.長治醫學院基礎醫學部生化教研室,山西 長治 046000

2.運城護理職業學院,山西 運城 044000

3.長治醫學院附屬和濟醫院內分泌科,山西 長治 046000

4.長治醫學院基礎醫學部病生教研室,山西 長治 046000

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是由于自然絕經或卵巢切除導致體內雌激素水平下降,鈣吸收不良,骨質流失[1-2]等全身代謝性骨病,超過30%的女性絕經后患有由骨質疏松引起的全身性骨痛和骨微結構改變。目前治療PMOP的方法很多,經典的治療方法是雌激素替代療法(estrogen replacement therapy,ERT)。雌激素通過刺激成骨細胞分泌胰島素樣生長因子、骨保護素、轉化生長因子,抑制破骨細胞成熟,刺激成骨細胞分化[3],其療效肯定,但長期應用有增加冠心病、子宮內膜癌、乳腺癌等發生的風險,尤其是對雌激素敏感的乳腺癌患者及乳腺癌高風險人群[4]。因此,尋找更為理想的化合物輔助治療PMOP成為目前研究的熱點。

白藜蘆醇(resveratrol,RSV)是一種相對分子質量為228的天然植物雌激素,存在于多種水果、蔬菜和中藥中。RSV可調節骨細胞代謝和骨轉換[5],能有效降低機體老化和絕經后雌激素缺乏引起的骨質疏松[6]。RSV通過多種機制促進成骨細胞增殖分化和抑制破骨細胞生成,如通過Wnt/β-catenin信號通路促進犬骨髓間充質干細胞的成骨分化[7];通過活化SIRT-1/FoxO1通路促進間充質干細胞向成骨細胞方向分化[8];通過促進自噬誘導小鼠前成骨細胞MC3T3-E1的增殖和分化[9],0.1～10 μmol/L濃度范圍的RSV通過抑制自噬來抑制破骨細胞的分化[10];RSV以40 mg/(kg·d)、80 mg/(kg·d)灌胃10周可通過提高骨密度和改善骨微結構來防止卵巢切除術引起的骨質量惡化[11]。盡管RSV對骨質疏松癥影響的數據不斷積累,但對于腹腔注射白藜蘆醇相較于雌二醇的效果和安全性實驗較少。本研究在選擇給藥方式時,綜合生物利用度、給藥難度、藥物劑型等因素,最終選擇腹腔注射。通過制作絕經后骨質疏松模型,對比RSV及雌二醇對PMOP的影響,以期為RSV作為潛在治療PMOP的輔助性用藥提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:8周齡雌性SD大鼠購自北京華阜康生物科技有限公司(許可證號:SCXK2019-0008)。大鼠在SPF級動物實驗室飼養,相對濕度60%,溫度25 ℃,光/暗循環12 h。采用統一標準飼料喂養,各組飼養條件相同。本研究經長治醫學院動物倫理審查委員會批準同意。

1.1.2實驗試劑與儀器:白藜蘆醇(RSV,C14H12O3,R8350)購自Solarbio(中國北京)。二甲基亞砜(DMSO,Solarbio,北京,中國)溶解白藜蘆醇。β-雌二醇(CAS:50-28-2)購自sigma公司。肌酐測定試劑盒(C011-2-1)及尿素氮測試盒(C013-2-1)購自南京建成生物工程研究所。全身雙能X射線吸收儀(DXA,Hologic ASY-00409)購自美國Hologic公司。

1.2 實驗方法

1.2.1構建大鼠PMOP模型及樣本收集:適應性喂養2周后,將50只大鼠隨機分為5組(每組10只):正常(CONTROL)組、假手術(Sham)組、去卵巢(OVX)組、OVX+白藜蘆醇(OVX+RSV)組、OVX+雌激素(OVX+E)組。OVX組大鼠手術切除雙側卵巢,Sham組切除卵巢周圍相同大小的脂肪,見圖1。術后1周,OVX+RSV組腹腔注射RSV[10 mg/(kg·d)],OVX+E組腹腔注射β-雌二醇[0.1 mg/(kg·d)]。Sham組和OVX組注射生理鹽水。每周稱量體重,干預12周后,收集所有動物血清、雙側股骨、心臟、肝臟、胰腺和腎臟。

圖1 背側雙切口切除雌性SD大鼠雙側卵巢Fig.1 Bilateral ovariectomy of female SD rats through dorsal double incisions

1.2.2蘇木精-伊紅(HE)染色:右側股骨用4%多聚甲醛固定,切片前用EDTA脫鈣液脫鈣21 d。將脫水的樣品包埋于石蠟中,切片4 μm厚,HE染色,倒置顯微鏡下觀察,采集圖像。

1.2.3Goldner染色:解剖后,左側股骨在4%多聚甲醛中固定24 h后,通過梯度濃度的乙醇(70%～100%)和二甲苯脫水,嵌入甲基丙烯酸甲酯(MMA),對5 μm厚的切片進行Goldner染色。

1.2.4雙能X射線吸收分析:各組SD大鼠于測量前12 h禁食禁水,腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后,放置于全身雙能X射線吸收儀掃描,采用高分辨率模式,檢測骨密度(BMD,g/cm2)、體脂率(BFP,%)和肌肉量(Lean mass,%),每4周檢測1次。最終由設備制造商提供小動物身體組成軟件(Hologic QDR軟件的Windows XP,版本12.3)完成數據分析。

1.2.5臟器系數:實驗12周后,所有動物禁食24 h,記錄安靜狀態下大鼠體質量;腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg),取心臟、肝臟、胰腺和腎臟,并稱重。臟器系數表示為[器官質量(g)/體質量(g)]×100%。

1.2.6血清肌酐及血清尿素氮水平的測定:大鼠取仰臥位,30 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后于腹主動脈取血至負壓采血管中,室溫靜置1 h,8 000 r/min離心,共10 min,取上層血清,使用試劑盒檢測各組大鼠血清肌酐及尿素氮水平。

1.3 統計學處理

數據以均數±標準誤(SEM)表示。使用SPSS 26.0軟件通過單因素方差分析(ANOVA)評估各組間的統計差異。方差相等時采用最小差異檢驗(least significant difference,LSD),方差不相等時采用Tamhane ’s T2檢驗,P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 白藜蘆醇對大鼠體重的影響

在12周內,每組大鼠體重均在一定范圍內波動,總體呈上升趨勢(圖2),統計學分析結果顯示各組間均無顯著性差異(P>0.05)。

圖2 不同組別大鼠每周體重變化Fig.2 Weekly weight changes of rats in different groups

2.2 白藜蘆醇對骨組織形態學的影響

HE染色結果顯示,CONTROL組及Sham組骨小梁密集,具有排列規則的致密網絡。OVX組骨小梁變薄,小梁間隙增加,網絡結構破壞。OVX+E組處理12周后骨小梁結構有明顯改善。在大鼠RSV干預12周后,與OVX組相比,骨小梁網絡連接得到改善,且骨小梁結構更厚和更規則。Goldner染色結果顯示,與Sham組相比,OVX組股骨遠端礦化小梁(綠色區域)的數量和厚度均顯著降低。OVX組大鼠骨小梁數目和容積減小、髓腔加寬、出現骨小梁網絡結構破壞區,說明絕經后骨質疏松大鼠建模成功。與OVX組相比,OVX+RSV組與OVX+E組骨小梁數量和小梁厚度顯著增加,骨小梁分離度顯著降低,見圖3。

圖3 各處理組股骨HE染色及Goldner染色(50×)Fig.3 Femoral HE staining and Goldner staining were performed in each treatment group (50×)

2.3 白藜蘆醇對DXA測量結果的影響

2.3.1各組對大鼠BMD的影響:4周與8周時,各組間無顯著性差異(P>0.05),12周時,與Sham組相比,OVX組BMD顯著降低(P<0.05),與OVX組相比,OVX+RSV組與OVX+E組BMD升高,但差異不顯著(P>0.05),OVX+RSV組與OVX+E組之間無顯著性差異(P>0.05)。

2.3.2各組對大鼠BFP的影響:4周與8周時,各組間BFP無顯著性差異(P>0.05),12周時,與Sham組及OVX組相比,OVX+RSV組BFP降低不顯著(P>0.05),OVX+E組BFP顯著性降低(P<0.05),OVX+RSV組與OVX+E組之間無顯著性差異(P>0.05)。

2.3.3各組對大鼠肌肉含量的影響:4周與8周時,各組間肌肉含量無顯著性差異(P>0.05),12周時,與Sham組及OVX組相比,OVX+RSV組肌肉含量無顯著變化(P>0.05),OVX+E組肌肉含量明顯升高(P<0.05),OVX+RSV組與OVX+E組之間無顯著性差異(P>0.05),見圖4。

圖4 各組大鼠DXA測量結果分析Fig.4 Analysis of DXA measurement results of rats in each group

2.4 白藜蘆醇對大鼠臟器系數的影響

通過各組間臟器系數比較顯示(圖5),肝臟、胰腺及心臟系數各組之間無顯著性差異(P>0.05);與CONTROL組和OVX組相比,OVX+RSV組的腎臟系數顯著降低(P<0.05),OVX+RSV組與OVX+E組各臟器系數之間無顯著性差異(P>0.05)。

圖5 各組大鼠各臟器系數結果統計Fig.5 Statistics of coefficients of various organs of rats in each group

2.5 白藜蘆醇對血清肌酐及血清尿素氮水平的影響

與CONTROL組及OVX組相比,OVX+RSV組大鼠空腹血清尿素氮和肌酐水平均顯著降低(P<0.05),OVX+E組肌酐水平顯著降低(P<0.05),見表1。

表1 RSV對大鼠血清尿素氮及血清肌酐水平的影響

3 討論

PMOP主要是由于體內雌激素水平下降引起全身骨量減少的代謝性疾病[12]。20世紀70年代已有臨床研究證實ERT可以緩解絕經后的骨質疏松。然而,長期服用雌激素存在誘發腫瘤、心血管疾病等風險[4]。植物雌激素是一類在結構或功能上模仿哺乳動物雌激素的植物源非甾體化合物,可以抑制骨吸收,促進骨形成,同時可以克服ERT的副作用[13]。有文獻表明植物雌激素可以通過ER或非ER通路影響骨代謝,如淫羊藿苷通過激活雌激素受體介導的BMP/Smad信號轉導通路促進前成骨細胞MC3T3-E1的分化[14-15],補骨脂素可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路顯著提高PMOP模型大鼠的骨密度、骨鈣素等指標,改善絕經后大鼠的骨質疏松[16]。RSV作為一種天然雌激素,已有文獻表明其作用機制為:通過抑制ROS/HIF-1α信號通路,促進成骨細胞的生成[17];激活雌激素介導的細胞外信號調節激酶(ERK)1/2和JNK信號通路調控成骨細胞的分化和增殖[18];通過SIRT1和Wnt/-catenin信號通路降低PPARγ水平促進成骨分化[19]。本課題組前期研究表明RSV在體外通過CaN/NFATc1通路促進前成骨細胞MC3T3-E1的分化和成熟[20],但RSV在臨床應用中的安全性和有效性仍有待驗證。因此,本實驗通過建立絕經后骨質疏松動物模型,探討RSV抗PMOP的效果與安全性。

白藜蘆醇對大鼠體重影響的結果顯示,體重的增長各組間無顯著性差異,說明腹腔注射10 mg/(kg·d) RSV對體重影響不明顯。BMD檢測結果表明,12周時,與Sham組相比,OVX組BMD顯著降低,說明切除卵巢可顯著降低BMD導致骨質疏松的發生。與OVX組相比,OVX+RSV組與OVX+E組BMD保持與CONTROL組相近的BMD,說明白藜蘆醇與雌二醇有相似的緩解BMD降低的作用。BFP檢測結果表明,12周時,OVX+E組BFP顯著降低。由于雌激素能夠調控成骨和成脂分化,當雌激素缺乏時,機體會出現成骨分化和脂肪代謝障礙,從而引發骨質疏松癥和中心性肥胖[21],脂肪在體內過度堆積導致體脂率增高,所以雌二醇的補充可有效降低BFP。而白藜蘆醇降BFP的效應則較緩和,與CONTROL組和Sham組相比,BFP有所下降,但作用不顯著。通過對大鼠肌肉含量的測定可以看出,12周時,OVX+E組肌肉含量顯著升高,可能由于雌激素作用于成肌細胞表面受體,促進成肌細胞的增殖分化[22]。此外,Kohara[23]的研究表明,脂質庫增加能降低氨基酸的利用率和肌纖維蛋白的合成量,因此,體內脂肪過多可能會誘發和加劇肌肉減少。由此可知,隨著體脂率的上升,肌肉含量相應減少。對于OVX+RSV組來說,作用較為溫和,與CONTROL組和Sham組相比差異不顯著。

臟器系數結果表明,除白藜蘆醇顯著降低腎臟系數外,肝臟、胰腺及心臟系數各組間差異不顯著。臟器系數降低常提示臟器萎縮或功能受損[24],說明白藜蘆醇可能會造成腎臟功能損傷。因此,為了進一步確定腎功能狀態,行大鼠空腹血清尿素氮和肌酐水平測定,血尿素氮主要由蛋白質分解代謝而來,經腎小球濾過隨尿排出,血中尿素氮水平升高往往見于器質性腎功能損傷。血清中肌酐主要通過骨骼肌中磷酸肌酸的非酶促反應生成,經腎小球濾過隨尿排出體外,當腎功能障礙時,肌酐排出受阻,血中濃度升高。因此,臨床上常用血尿素氮和肌酐水平作為評估腎功能的指標[25]。本研究結果顯示,與CONTROL組及OVX組相比,OVX+RSV組大鼠空腹血清尿素氮和肌酐水平均顯著降低,OVX+E組肌酐水平顯著降低,因此,并未發現白藜蘆醇造成腎功能障礙。當然,也有實驗數據表明,SD 大鼠白藜蘆醇[3 000 mg/(kg·d)]灌胃28 d出現血清尿素和肌酐水平升高,腎臟組織病理學改變的發生率和損傷程度加重,表現出腎毒性[26]。本實驗選擇腹腔注射白藜蘆醇10 mg/(kg·d)并未出現腎功能障礙,可能與給藥劑量、給藥方式及給藥時間有關?？傊?臟器系數只是從整體上反映白藜蘆醇對主要器官是否有損傷,而對各臟器的形態學改變并不能判別,后續課題組將進一步通過整體和微觀兩方面進行實驗研究。

骨組織HE染色和Goldner染色結果顯示,OVX組出現骨質疏松征象,如骨小梁排列稀疏,骨小梁變薄斷裂。與OVX組相比,OVX+RSV組與OVX+E組骨小梁數量和小梁厚度顯著增加,骨小梁網絡連接得到改善,骨小梁分離度降低。說明白藜蘆醇能夠有效改善雌激素降低引起的骨質疏松,且其效果與雌二醇相當。亦有動物實驗表明,白藜蘆醇8.4 mg/(kg·d)灌胃8周可增加骨密度、提高骨強度、促進骨形成[27]。

綜上所述,腹腔注射白藜蘆醇具有與雌激素相當的提高大鼠股骨BMD的作用,且未發現有明顯毒副作用,具有較高安全性,為白藜蘆醇在抗骨質疏松方面的應用提供了理論基礎。