氣相色譜法測定醬油中對羥基苯甲酸甲酯的不確定度評定

崔婷婷，喬牡冬

（中國地質調查局呼和浩特自然資源綜合調查中心，呼和浩特 010010）

醬油由多種谷物多種工藝釀造而成，是生活中常用的調味品[1-2]，醬油中常添加一定的防腐劑用于保鮮，我國國家標準GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》規定使用的防腐劑有26種，其中對羥基苯甲酸甲酯屬于對羥基苯甲酸酯類。對羥基苯甲酸甲酯(尼鉑金酯)為白色結晶粉末，具有抗菌功能，應用范圍廣，毒性低[3-4]，可以穿過細胞膜，讓蛋白質變性，抑制細胞的呼吸酶活性和傳遞酶活性，起到防腐作用[5-6]，應用于化妝品、食品等行業[7]。對羥基苯甲酸甲酯毒性較低，比鈉鹽、山梨酸、苯甲酸防腐效果好并且穩定，常作為防腐劑使用。過量使用防腐劑可能會對人體造成傷害，影響生育能力[8]。目前，國家對于食品中添加防腐劑的量有嚴格的控制，GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》中明確規定：醬油中對羥基苯基酸甲酯的最大使用量為0.25 g/kg。當前，對于對羥基苯甲酸甲酯的檢測方法有氣相色譜法[9]、液相色譜法[10-11]、氣相色譜-質譜法[12]。醬油中的對羥基苯甲酸甲酯在檢測過程中，檢測結果與使用限量可能會接近，甚者則超過臨界值，測定數據的準確性嚴重影響實驗人員對于結果的判斷，所以針對醬油中對羥基苯甲酸甲酯含量測定的不確定度評定，可以更加客觀、合理地評價檢測結果[13-15]。

依據國家標準GB 5009.31—2016《食品安全國家標準 食品中對羥基苯甲酸酯類的測定》，利用氣相色譜儀檢測醬油中對羥基苯基酸甲酯的含量。按照JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》和JJG 196—2006《常用玻璃量器鑒定規程》要求，對檢測結果的不確定度進行評估，分析不確定度的主要來源，通過對醬油樣品重復測定、醬油樣品稱量、對羥基苯基酸甲酯標準溶液量取、對羥基苯基酸甲酯標準溶液純度、對羥基苯基酸甲酯標準溶液配制過程中所使用的玻璃器具、標準曲線擬合引入的不確定度進行評定，以期提供科學、合理的檢測數值，從而提高檢測結果的準確性，保證最終結果的可靠性。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜儀：GC-2010 型，日本島津企業管理(中國)有限公司。

電子天平：BSA200S-WEⅠ型，感量為0.001 g，德國賽多利斯公司。

超純水機：XYG-90-H 型，北京湘順源科技有限公司。

對羥基苯甲酸甲酯標準溶液：1 000 μg/mL，批號為80699JA，壇墨質檢科技股份有限公司。

丙酮、乙醚：均為色譜純，天津市富宇精細化工有限公司。

無水乙醇：色譜純，天津市北聯精細化學品開發有限公司。

鹽酸：色譜純，天津市匯源化工有限公司。

氯化鈉、碳酸氫鈉：分析純，天津市津東天正精細化學試劑廠。

硫酸鈉：分析純，天津市北聯精細化學品開發有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制

準確量取對羥基苯甲酸甲酯標準溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，以丙酮定容，配制成質量濃度為100 μg/mL的對羥基苯甲酸甲酯中間液。用移液管分別吸取對羥基苯甲酸甲酯中間液5、2、1、0.4 mL于10 mL容量瓶中，以丙酮定容，配制成質量濃度分別為50、20、10、4 μg/mL 的對羥基苯甲酸甲酯系列標準工作溶液。

1.2.2 樣品處理

采用國家標準GB 5009.31—2016《食品安全國家標準 食品中對羥基苯甲酸酯類的測定》方法處理醬油樣品，采取直接取樣的方法，稱取5 g (精確至0.001 g)醬油樣品于小燒杯中，并轉移至125 mL 分液漏斗中，用10 mL 飽和氯化鈉溶液分次洗滌小燒杯，合并洗滌液于125 mL分液漏斗，加入1 mL鹽酸溶液(37%濃鹽酸和水體積比為1∶1)酸化，搖勻，分別以75、50、50 mL 無水乙醚各提取1 次，每次2 min，放置1～2 min，棄去水層，合并乙醚層于250 mL分液漏斗中，加入10 mL飽和氯化鈉溶液洗滌一次，再分別以碳酸氫鈉溶液30、30、30 mL洗滌三次，棄去水層。用濾紙吸去漏斗頸部水分，將有機層經過無水硫酸鈉(約20 g)濾入濃縮瓶中，在旋轉蒸發儀上濃縮近干，用氮氣除去殘留溶劑，準確加入2.0 mL無水乙醇溶解殘留物，作為樣品溶液。

1.2.3 氣相色譜儀工作條件

色譜柱：HP-5 毛細管柱[30 m×0.25 mm，0.25 μm，日本島津企業管理(中國)有限公司]；進樣口溫度：220 ℃；檢測器溫度：260 ℃；分流比：10∶1；色譜柱流量：1.0 mL/min；H2流量：40 mL/min；尾吹氣流量：3 mL/min；空氣流量：400 mL/min；程序升溫：100 ℃保持1 min，以20 ℃/min 升溫至170 ℃，再以12 ℃/min 升溫至220 ℃，保持10 min，以10 ℃/min升溫至250 ℃，保持6 min；定量方法：色譜峰面積外標法。

1.2.4 測量模型

依據GB 5009.31—2016《食品安全國家標準 食品中對羥基苯甲酸酯類的測定》測定醬油樣品中對羥基苯甲酸甲酯的含量，按照式(1)進行計算：

式中：wx——醬油樣品中對羥基苯甲酸甲酯的質量分數，mg/kg；

ρ——由標準曲線計算的樣品溶液中對羥基苯甲酸甲酯的質量濃度，μg/mL；

V——定容體積，mL；

f——換算因子，0.907 8；

m——醬油樣品質量，g。

2 測量不確定度來源

根據1.2.4測量模型和檢測過程分析，醬油中對羥基苯甲酸甲酯含量測量不確定度的來源有：(1)醬油樣品重復測定引入的不確定度；(2)醬油樣品稱量引入的不確定度；(3)對羥基苯甲酸甲酯標準溶液量取引入的不確定度；(4)對羥基苯甲酸甲酯標準溶液濃度引入的不確定度；(5)對羥基苯甲酸甲酯標準溶液配制過程中所使用的玻璃器具引入的不確定度；(6)標準曲線擬合過程引入的不確定度。

3 不確定度分量的評定

3.1 樣品重復測定引入的相對標準不確定度urel(R)

樣品重復測定屬于A類不確定度?？瞻揍u油樣品加入對羥基苯甲酸甲酯標準溶液(20 μg/mL)，6次重復檢測(n=6)，測定值(ρi)分別為20.894、19.928、18.428、18.804、18.497、18.560 μg/mL，平 均 值ρˉ=19.185 μg/mL。重復測定引入的不確定度為u(R)按照貝塞爾公式計算：

將測定數據代入式(2)，計算結果為：

3.2 樣品稱量引入的相對標準不確定度urel(m)

使用BSA200S-WEⅠ電子天平稱量醬油樣品，依據其檢定校準證書，最大允許誤差為0.5 mg。按照矩陣分布評定，擴展因子k= 3，其標準不確定度u(m)=0.5/k=0.289 mg，醬油樣品稱樣質量(m)為5.017 g，則稱量醬油樣品引入的相對標準不確定度：

3.3 標準溶液量取引入的相對標準不確定度urel(Vs，0)

單標線移液管1.0 mL 量取對羥基苯甲酸甲酯標準溶液，最大允許誤差0.005。按照矩陣分布評定標準不確定度，k= 3，則對羥基苯甲酸甲酯標準溶液量取引入的標準不確定度為u(Vs，0)=0.005/k=0.002 887 mL，對羥基苯甲酸甲酯標準溶液量取為1.0 mL，則：

3.4 對羥基苯甲酸甲酯標準溶液濃度引入的相對標準不確定度urel(ρs，0)

由對羥基苯甲酸甲酯標準溶液證書可知，質量濃度標準值ρs=1 000 μg/mL，相對擴展不確定度為2%(k=2)，則相對標準不確定度：

3.5 對羥基苯甲酸甲酯標準溶液配制過程所用玻璃器具產生的相對標準不確定度urel(Vs)

實驗過程中玻璃器具的主要不確定度為溫度和容量允許誤差(δ)。實驗具體操作溫度為25 ℃，而國家計量技術規程JJG 196—2006《常用玻璃量器鑒定規程》中檢定溫度要求為20 ℃，實驗過程中的玻璃器具檢定溫度與實際操作溫度相差5 ℃，只需考慮液體的體積膨脹[16]。對羥基苯甲酸甲酯標準溶液的溶劑為丙酮，丙酮的膨脹系數為0.001 49 ℃-1，則溫度變化產生的標準不確定度為u(VT)=(0.001 49×5×V)/k(V為玻璃器具規格，按均勻分布計算k= 3)；容量允許誤差(δ)引入的標準不確定度為u(Vδ)=δ/k(按均勻分布k= 3)，則合成標準不確定度為u(Vs，i)=相 對 標 準 不 確 定 度 為urel(Vs，i)=u(Vs,i)/Vs,i。對羥基苯甲酸甲酯標準溶液中間液稀釋過程按照1.2.1標準溶液配制，共使用10 mL容量瓶5 次，1 mL 移液管2 次，0.5、2、5 mL 移液管各1 次。配制對羥基苯甲酸甲酯標準溶液時玻璃器具校準引入的不確定度見表1。根據表1數據，對羥基苯甲酸甲酯標準溶液配制中玻璃器具引入的相對標準不確定度：

表1 玻璃器具引入的不確定度Tab.1 Uncertainty introduced by glassware

將各不確定度分量數據帶入公式(3)，計算得：

3.6 對羥基苯甲酸甲酯標準曲線擬合過程產生的相對標準不確定度urel(L)

根據GB 5009.31—2016《食品安全國家標準 食品中對羥基苯甲酸酯類的測定》，分別配制并測定5種不同濃度的對羥基苯甲酸甲酯標準溶液，利用對應色譜峰面積的對數Y及溶液質量濃度ρ數據進行線性回歸，得標準曲線線性方程為Y=0.007 947 80ρ，相關系數r=0.998，標準曲線數據見表2。

表2 標準曲線數據Tab.2 Standard curve data table

對空白醬油樣品加入對羥基苯甲酸甲酯進行6次重復檢測，平均質量濃度ρˉ為19.185 μg/mL，由標準曲線擬合的相對標準不確定度按(4)計算：

式中：s——對羥基苯甲酸甲酯標準溶液峰面積的標準

P——樣品平行檢測次數，P=6；

n——對羥基苯甲酸甲酯標準溶液檢測次數，n=6；

ρˉ標——標準系列溶液的平均質量濃度，ρˉ標=36.047 8 μg/mL。

將上述帶入公式(4)計算，標準曲線擬合引入的標準不確定度u(L)=0.000 011 μg/mL，相對標準不確定度urel(L)=u(L)/ρ=0.000 001。

3.7 合成相對標準不確定度urel(ρx)

綜上，試驗過程中，影響檢驗結果的各個因素引入的相對標準不確定度見表3。由表3可知，醬油樣品重復性測定、醬油樣品稱量是不確定度的主要來源，而對羥基苯基酸甲酯標準溶液量取、對羥基苯基酸甲酯標準溶液純度、對羥基苯基酸甲酯標準溶液配制過程中所使用的玻璃器具、標準曲線擬合引入的不確定度影響不大。

表3 相對標準不確定度一覽表Tab.3 List of relative standard uncertainty

合成相對標準不確定度：

將各不確定度分量數據帶入公式(5)，計算得urel(ρx)=0.080 280。無對羥基苯甲酸甲酯的醬油空白樣品加入對羥基苯甲酸甲酯標準溶液，測得平均值為ρˉ=19.185 μg/mL，醬油樣品最后注入氣相色譜儀的定容體積V=2.0 mL，樣品取樣質量為5.017 g，換算因子f為0.907 8，根據1.2.4測量模型，對羥基苯甲酸甲酯的平均質量分數為6.94 mg/kg。

合成標準不確定度：

3.8 擴展不確定度U

醬油中對羥基苯甲酸甲酯含量測定的擴展不確定度為U=ux×k=3.080 325 mg/kg (置信概率P=95%，包含因子k=2)。

3.9 結果報告

氣相色譜法測定空白醬油樣品加入20 μg/mL對羥基苯甲酸甲酯標準溶液，重復測定6次，其平均含量為(6.94±3.08) mg/kg，k=2。

4 結語

利用氣相色譜法測定醬油中對羥基苯甲酸甲酯的含量過程進行不確定度評定，醬油樣品重復性測定、醬油樣品稱量是不確定度的主要來源，而對羥基苯基酸甲酯標準溶液量取、對羥基苯基酸甲酯標準溶液純度、對羥基苯基酸甲酯標準溶液配制過程中所使用的玻璃器具、標準曲線擬合引入的不確定度影響不大，因此在測定過程中，實驗人員實驗過程中，注意標準操作，避免由于個人原因帶來的誤差，最大程度地保證實驗過程中操作的嚴謹性，從而提高檢測準確性。