基于RNA-Seq技術篩選姜曲海豬子宮和卵巢發育相關基因

朱淑斌, 徐 盼, 周春寶, 許琴瑟, 吳嘉韻

(1.江蘇農牧科技職業學院,江蘇 泰州 225300; 2.姜曲海豬保種場,江蘇 泰州 225300)

母豬高產和健康的保持一直是養豬業面臨的最大挑戰之一。母豬繁殖障礙主要表現為不發情或發情異常、不孕或受孕率低、早產、流產以及產胎率低等臨床癥狀。產仔數、產活仔數和窩質量是評估母豬繁殖性能的重要指標,母豬的繁殖能力低會直接影響生豬生產效益[1-2]。母豬的繁殖器官結構復雜,任何一個組成部分出現異常都會導致繁殖障礙,其中子宮和卵巢的發育情況備受重視,它們在母豬繁殖過程中具有重要的作用[3-4]。因此,圍繞母豬子宮和卵巢發育過程中的轉錄變化進行深入研究,挖掘影響母豬生殖器官發育的重要功能基因,可以進一步通過分子選育對功能基因進行篩選和鑒定,有望減少母豬繁殖障礙現象的發生,進而提高母豬的繁殖性能。

RNA-Seq是目前分子生物學研究領域使用最為廣泛的組學技術之一,具有通量高、效率高和成本低的優點。RNA-Seq可以全面提供樣本基因轉錄本的表達信息,讓研究者快速了解樣本轉錄差異的整體規律。近十年來,RNA-Seq技術的快速發展,使其在畜牧研究中得到廣泛應用。段修軍等[5]通過對黑羽番鴨胸肌、腿肌中揮發性風味物質進行測定,并利用RNA-Seq技術篩選得到可能通過形成肌內揮發性風味物質進而影響肌肉風味的候選基因。安清明等[6]利用RNA-Seq技術篩選貴州白山羊肌肉生長發育的候選基因。蘇比奴爾·艾力等[7]基于RNA-Seq技術對塔里木馬鹿毛色相關基因進行篩選及分析,篩得7個候選基因可能在塔里木馬鹿毛色形成過程中發揮重要作用。梁鵬等[8]利用RNA-Seq技術分析灘羊、杜泊羊和小尾寒羊肉品質變化和肌肉內基因的表達情況,挖掘它們肉質性狀差異的相關調控基因,為其他綿羊品種選育與改良提供理論依據。此外,在豬養殖中,目前也有許多研究人員應用RNA-Seq技術挖掘豬種優良性狀的功能基因,相關研究結果對增加豬產肉量、增強豬抗病力和提高豬群繁殖力具有重要的參考價值[9]。Fraser等[10]利用RNA-Seq技術比較不同冷凍公豬精子的轉錄譜,為進一步闡明精子與其低溫存活相關基因的研究提供了基礎,鑒定到的關鍵候選基因具有作為預測豬精液冷凍性標記的潛力。徐盼等[11]基于RNA-Seq技術鑒定90日齡與180日齡蘇姜豬背最長肌之間以及180日齡蘇姜豬背最長肌與腿肌之間的差異表達基因,為后續蘇姜豬肌肉生長發育的分子改良提供了一定的研究基礎。

姜曲海豬的主要產區位于泰州市姜堰區、南通市曲塘鎮、南通市海安市一帶,此類豬種全身被毛黑色,其中有部分豬在鼻吻處偶有白斑,外號“花鼻子”,其具有早熟易肥、繁殖性能強的優勢[12-13]。母豬1月齡生殖系統發育還未完全,未達到性成熟,8月齡姜曲海母豬已達到性成熟,具備完整的繁育能力。因此,本研究擬利用RNA-Seq技術對1月齡和8月齡的姜曲海豬子宮和卵巢組織進行研究,篩選和分析差異表達基因,挖掘發育性狀相關的有效基因,以期為研究姜曲海豬繁育的分子機理水平提供基礎數據和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本次試驗動物材料來源于江蘇姜曲海豬豬種有限公司。隨機選取6頭同窩體質量相近[體質量(6.87±0.21) kg]的健康姜曲海母豬進行標準化飼養,在1月齡和8月齡時期各屠宰3頭,于屠宰后30 min內采集子宮(子宮角部位)和卵巢組織樣品置于凍存管,分別命名為:1月齡-子宮-編號(1M-ute-1、1M-ute-2、1M-ute-3)、8月齡-子宮-編號(8M-ute-1、8M-ute-2、8M-ute-3)、1月齡-卵巢-編號(1M-ova-1、1M-ova-2、1M-ova-3)、8月齡-卵巢-編號(8M-ova-1、8M-ova-2、8M-ova-3),放入液氮罐帶回實驗室,再轉移到-80 ℃冰箱內長期保存,用于總RNA的提取。

1.2 主要儀器及試劑

TRIzol(貨號:15596018)、Oligo磁珠(貨號:B-3002)購自廣東潤科生物工程股份有限公司;瓊脂糖(貨號:C042)購自上海如吉生物科技有限公司;反轉錄試劑盒(貨號:B300537)、實時熒光定量PCR試劑盒(貨號:B639271)購自生工生物工程(上海)股份有限公司;分光光度計(型號:K5500)購自北京凱奧科技發展有限公司;細胞分析儀(型號:2100Bio-analyzer)購自Agilent公司;定量PCR儀(型號:CG-02)購自HealForce公司;測序儀(型號:HiseqTM2500)購自Illumina公司。

1.3 RNA提取及轉錄組測序

利用TRIzol法提取各子宮和卵巢組織樣本的總RNA?？俁NA質量經檢測后分離純化mRNA,合成cDNA并加測序接頭后回收目的片段,進行PCR擴增。構建好的文庫利用PE150測序策略進行測序,以此得到原始數據raw read[7]。

1.4 RNA-Seq數據處理及分析

通過軟件FastQC(v0.11.2)對測序的原始數據進行質量評估,通過軟件Trimmomatic(v0.36)進行質量剪切,去掉測序接頭及低質量序列后,得到相對準確的高質量的有效數據(clean read)。利用HiSAT2(v2.1.0)軟件將樣本有效數據與豬的參考基因組[Scrofa10.2 (fp://ftp.ensembl.org pub/release 87/fasta/sus_ scrofa/dna/)]進行比對,統計Mapping信息。將唯一比對到基因組的基因用于差異基因表達分析,使用每千個堿基轉錄每百萬映射讀取的碎片(TPM)法對每個樣本中基因的表達量進行標準化。以|log2FoldChange|>2(FoldChange表示表達量差異倍數)和P<0.05為標準,統計篩選差異表達基因。使用DESeq2(v1.26.0)軟件進行基因差異表達分析。利用GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析將差異表達基因注釋到相應的GO和KEGG信號通路上,進一步將差異表達基因與豬QTL數據庫進行比對,以鑒定姜曲海豬子宮和卵巢組織中與發育性狀有關的候選基因。

1.5 qRT-PCR檢測

隨機挑選RNA-Seq篩選的10個差異表達基因,使用實時熒光定量PCR試劑盒進行實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)檢測。20.0 μl qRT-PCR反應體系為:10.0 μl實時熒光定量試劑盒預混液,0.4 μl上游引物(10 μmol/L),0.4 μl下游引物(10 μmol/L),2.0 μl cDNA,7.2 μl雙蒸水(RNase free ddH2O)。擴增程序為:95 ℃ 3 min;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,45個循環。利用Primer 6.0軟件,跨外顯子設計所篩選基因的qRT-PCR引物,以GAPDH基因作為內參基因。所有引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成,引物詳細信息見表1。每組qRT-PCR檢測3個重復,利用SPSS 20.0軟件進行t檢驗[14],本研究對qRT-PCR和RNA-esq結果進行了Pearson相關性分析。

表1 qRT-PCR引物信息

2 結果與分析

2.1 RNA-Seq數據質控分析

通過對RNA-Seq測序數據進行質控分析發現,姜曲海豬的子宮和卵巢組織樣本平均read數如表2所示,clean read的數量和比對結果符合要求。同時,子宮和卵巢的3D主成分分析(PCA)結果、基因表達量密度以及組間的相關性分析結果表明,組間樣本差異較小(圖1A～圖1C)。上述結果均表明測序質量較高,為下一步數據分析的可靠性奠定了基礎。此外,由圖1D可知,1月齡和8月齡的子宮和卵巢組織樣本共有的基因表達數為19 435個,后續生物信息學分析將基于該共有表達基因開展。

表2 子宮和卵巢組織樣本比對參考基因組結果

A:子宮和卵巢的3D主成分分析(PCA)結果;B:基因表達量密度曲線圖,TPM:每千個堿基轉錄每百萬映射讀取的碎片;C:組間的相關性分析,數值表示組間相關性;D:組間共表達基因韋恩圖。重疊區數字代表不同組共有的基因表達數,非重疊區數字代表特異的基因表達數。1M-ute-1、1M-ute-2、1M-ute-3、8M-ute-1、8M-ute-2、8M-ute-3、1M-ova-1、1M-ova-2、1M-ova-3、8M-ova-1、8M-ova-2、8M-ova-3見表2注。

1M-ute-1、1M-ute-2、1M-ute-3分別表示1月齡子宮組織樣本的3組重復;8M-ute-1、8M-ute-2、8M-ute-3分別表示8月齡子宮組織樣本的3組重復;1M-ova-1、1M-ova-2、1M-ova-3分別表示1月齡卵巢組織樣本的3組重復;8M-ova-1、8M-ova-2、8M-ova-3分別表示8月齡卵巢組織樣本的3組重復。

2.2 不同分組基因分布及差異表達基因鑒定

本研究設置閾值為|log2FoldChange|>2、P<0.05的標準來篩選差異表達基因。結果(圖2A)顯示,1月齡姜曲海豬子宮和卵巢組織的基因表達水平相近;8月齡姜曲海豬子宮組織的基因表達水平低于卵巢組織;姜曲海豬子宮和卵巢組織的基因表達水平都表現為8月齡組高于1月齡組。圖2B顯示,1月齡和8月齡姜曲海豬卵巢組織上調差異表達基因個數明顯多于下調差異表達基因個數。由圖3可知,1月齡和8月齡姜曲海豬子宮組織中有1 688個差異表達基因,其中表達上調的基因有844個,表達下調的基因有844個(圖3A);1月齡和8月齡姜曲海豬卵巢組織中存在3 833個差異表達基因,有2 831個表達基因上調,1 002個表達基因下調(圖3B)。此外,1月齡姜曲海豬子宮和卵巢組織中的差異表達基因有978個基因表達上調,765個基因表達下調(圖3C);8月齡姜曲海豬子宮和卵巢組織中的差異表達基因有1 132個基因表達上調,2 919個基因表達下調(圖3D)。

A:比較組表達量箱型圖,縱軸為每千個堿基的轉錄每百萬映射的讀數(TPM)的對數;B:表達差異分析統計柱狀圖,縱軸為上調和下調的差異基因數量。1M-ute-1、1M-ute-2、1M-ute-3、8M-ute-1、8M-ute-2、8M-ute-3、1M-ova-1、1M-ova-2、1M-ova-3、8M-ova-1、8M-ova-2、8M-ova-3見表2注。

A:8月齡和1月齡子宮組織樣本間比較的差異表達基因數量;B:8月齡和1月齡卵巢組織樣本間比較的差異表達基因數量;C:1月齡子宮組織樣本和卵巢組織樣本間比較的差異表達基因數量;D:8月齡子宮組織樣本和卵巢組織樣本間比較的差異表達基因數量。圖中每個點代表一個基因,不同顏色代表不同基因類型,紅色、綠色和黑色分別表示上調基因、下調基因和無差異表達基因。1M-ute-1、1M-ute-2、1M-ute-3、8M-ute-1、8M-ute-2、8M-ute-3、1M-ova-1、1M-ova-2、1M-ova-3、8M-ova-1、8M-ova-2、8M-ova-3見表2注。

2.3 GO功能和KEGG信號通路富集分析

GO功能富集分析結果顯示,1月齡和8月齡卵巢組織的差異表達基因顯著富集于多細胞生物的發育、系統發育和細胞發育等過程(圖4A);1月齡和8月齡子宮組織的差異表達基因顯著富集于動物器官發育、組織發育和細胞分化等過程(圖4B);1月齡子宮和卵巢組織的差異表達基因極顯著富集于動物器官發育、組織發育、多細胞生物的發育等生物學過程(圖4C);8月齡子宮和卵巢組織的差異表達基因顯著富集于動物器官發育、組織發育、繁殖和生殖等過程(圖4D)。

通過KEGG信號通路數據庫對不同組的差異表達基因進行通路注釋發現,1月齡和8月齡卵巢組織的差異表達基因顯著富集于堿基切除修復和DNA復制(圖5A);1月齡和8月齡姜曲海豬子宮組差異表達基因無顯著通路富集,主要涉及的通路為Wnt信號通路和細胞色素P450對異種生物的代謝作用(圖5B);1月齡姜曲海豬子宮和卵巢組織的差異表達基因顯著富集于緊密連接信號通路(圖5C);8月齡姜曲海豬子宮和卵巢組織的差異表達基因無顯著通路富集,主要涉及的通路為調節干細胞多能性的信號通路和軸突導向等(圖5D)。

圖中點的大小表示差異表達基因的數量,點越大表示包含差異表達基因越多。1M-ute-1、1M-ute-2、1M-ute-3、8M-ute-1、8M-ute-2、8M-ute-3、1M-ova-1、1M-ova-2、1M-ova-3、8M-ova-1、8M-ova-2、8M-ova-3見表2注。

圖中點的大小表示差異表達基因的數量,點越大表示包含差異表達基因越多。1M-ute-1、1M-ute-2、1M-ute-3、8M-ute-1、8M-ute-2、8M-ute-3、1M-ova-1、1M-ova-2、1M-ova-3、8M-ova-1、8M-ova-2、8M-ova-3見表2注。

2.4 篩選候選基因結果

結合GO功能和KEGG信號通路顯著性富集分析結果,將差異表達基因與豬數量性狀基因座(QTL)數據庫(https://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/SS/index)進行比對,一共篩選出11個子宮中與發育性狀有關的候選基因(ADCY2、DIO2、MAGEL2、LHFPL1、CDH13、ITIH3、MTUS2、LIF、RBP4、EPHB2、TESC)以及31個卵巢中與發育性狀有關的候選基因(VRTN、FRAS1、LHFPL1、SDCCAG8、ITIH4、CPNE5、ARL4C、MTUS2、FGF14、SMTNL2、LIF、KIF5C、LEF1、PIWIL1、ZFYVE9、OSBPL10、RBP4、EPHB2、SPEF2、ESR2、ELOVL2、DCC、AREG、RIMKLA、WNT10B、HECW1、FUT2、TESC、WDHD1、DLGAP5、WNT3)。其中,2個組織中共同篩選得到的發育性狀差異表達基因有6個,分別為LHFPL1(LHFPL tetraspan subfamily member 1)、MTUS2(Microtubule associated scaffold protein 2)、LIF(Leukemia inhibitory factor)、RBP4(Retinol binding protein 4)、EPHB2(Erythropoietin-producing hepatocellular B2)和TESC(Tescalcin)。此外,我們將這6個共有的發育性狀差異表達基因在不同組間的表達繪制熱圖,發現除LIF和RBP4外的其他基因隨著母豬月齡的增大其表達水平在2個組織中均呈上升趨勢(圖6)。

A:卵巢和子宮共有的發育性差異表達基因Venn圖;B:共有的發育性差異表達基因在不同組間的表達熱圖。a:1M-ova-1;b:1M-ova-2;c:1M-ova-3;d:1M-ute-1;e:1M-ute-2;f:1M-ute-3;g:8M-ova-1;h:8M-ova-2;i:8M-ova-3;j:8M-ute-1;k:8M-ute-2;l:8M-ute-3。1M-ute-1、1M-ute-2、1M-ute-3、8M-ute-1、8M-ute-2、8M-ute-3、1M-ova-1、1M-ova-2、1M-ova-3、8M-ova-1、8M-ova-2、8M-ova-3見表2注。

2.5 qRT-PCR驗證結果

為進一步驗證差異表達基因的表達模式,隨機選取10個基因(EGR1、ACKR3、DUSP1、CCN2、SAT1、ASPN、ADGRA2、CCDC3、SFRP2、BGN)進行qRT-PCR驗證,Pearson相關性分析結果表明,qRT-PCR和RNA-Seq相關系數為0.811(P<0.01),這些基因的表達模式在RNA-Seq和qRT-PCR之間保持一致(圖7),表明轉錄組數據分析的可靠性和準確性高。

a:EGR1;b:ACKR3;c:DUSP1;d:CCN2;e:SAT1;f:ASPN;g:ADGRA2;h:CCDC3;i:SFRP2;j:BGN。

3 討 論

RNA-Seq能夠檢測物種特定組織或器官在某一狀態下的轉錄本序列信息,從而通過生物學分析手段篩選和鑒定該物種優良性狀的關鍵候選基因[15-19]。因此,目前RNA-seq已經廣泛應用于畜禽經濟性狀的研究當中,并且許多研究結果也進一步表明RNA-Seq技術在畜禽重要經濟性狀選育中的重要作用,基于RNA-Seq可以高效篩選特定性狀的關鍵候選基因[5-11]。因此,本研究利用RNA-Seq技術鑒定1月齡和8月齡姜曲海豬子宮和卵巢組織差異基因的表達譜,結果發現姜曲海豬卵巢組織不同月齡的差異表達基因多于子宮,表明在發育過程中卵巢組織發生了更多的轉錄變化,并且2個組織間的差異表達基因比較結果也表明不同組織的發育存在一定的差異性。

本研究對不同月齡不同組織中的差異表達基因進行富集分析,發現這些差異表達基因顯著富集于多細胞生物的發育生物學過程,相較于1月齡時期,8月齡的子宮和卵巢組織的差異表達基因在繁殖和生殖過程中顯著富集。1月齡和8月齡卵巢組的差異表達基因顯著富集于堿基切除修復和DNA復制信號通路。值得注意的是,在子宮和卵巢的發育過程中,差異表達基因顯著富集于Wnt信號通路,Wnt信號通路在女性生殖系統的發育中起著重要的作用, 是其分化形成的關鍵因子, 在胚胎干細胞定向分化為子宮內膜樣細胞的過程中,Wnt信號通路同樣起著關鍵的調控作用[20]。由此推測,在母豬子宮和卵巢的發育過程中Wnt信號通路發揮著調控細胞分化的關鍵作用。根據上述結果,本研究推測在姜曲海母豬子宮和卵巢的發育過程中以上信號通路發揮了潛在的調控作用,Wnt、堿基切除修復和DNA復制等信號通路及通路中的差異表達基因可能對姜曲海豬生殖器官的發育具有一定的調控作用,進而影響姜曲海母豬的繁殖性能。

為了進一步篩選與姜曲海豬子宮和卵巢發育相關的關鍵候選基因,本研究將差異表達基因與豬QTL數據庫進行比對后鑒定到6個潛在的重要候選基因。其中,LHFPL1基因位于X染色體上,是脂肪瘤HMGIC融合伙伴(LHFP)基因家族的一個成員,LHFPL1在人的大部分組織中廣泛表達,特別是在肺、胸腺、骨骼肌、結腸和卵巢中表達較高[21],其在卵巢中的高表達可能與其參與卵巢的發育相關。MTUS2是一種蛋白質編碼基因,研究發現MTUS2與肺非鱗狀非小細胞癌相關[22]。LIF基因位于第14號染色體上,參與造血、神經發育和內分泌調控等多種生命活動,在母體和胎兒界面的免疫耐受性方面也可能發揮作用[23-25]。RBP4基因位于第14號染色體上,屬于脂蛋白家族,可將視黃醇從肝臟儲存到外圍組織[26]。另有研究結果表明,RBP4可能通過抑制IRS/PI3K/Akt的磷酸化參與高尿酸血癥誘導的胰島素抵抗[27]。EPHB2屬于受體酪氨酸激酶跨膜糖蛋白的Eph受體家族,其在結直腸癌、胃癌、肝細胞癌等多種癌癥中均被證實異常表達,導致腫瘤發生和發展[28]。TESC亦稱為鈣調磷酸酶B同源蛋白3(CHP3),其在細胞生長和分化中起重要作用[29]。子宮和卵巢的發育過程中細胞會不斷發生分化,而本研究篩選到的候選基因中有很多參與細胞生長和分化相關的生命活動,因此,本研究初步推測這些候選基因在姜曲海豬的子宮和卵巢發育過程中發揮重要作用,今后有必要對這些候選基因進行進一步的功能驗證和探究。

4 結 論

本研究基于姜曲海這一地方豬品種繁殖性能強的優勢,利用RNA-Seq技術對影響姜曲海母豬子宮和卵巢組織發育相關的功能基因進行了深入的挖掘,揭示了姜曲海母豬發育過程中子宮和卵巢組織的基因表達圖譜,并成功鑒定到LHFPL1、MTUS2、LIF、RBP4、EPHB2和TESC等6個潛在的發育候選基因,有望為姜曲海豬繁殖性狀的分子改良提供良好的試驗依據和理論基礎,同時也為姜曲海豬子宮和卵巢發育分子層面的研究提供了新的研究方向。