包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS納米顆粒的制備及佐劑活性

秦 竹, 陳 瑾, 侯立婷, 喬緒穩, 李 蘭, 楊 利, 杜露平, 于曉明, 張元鵬, 鄭其升

(1.江蘇省農業科學院動物免疫工程研究所/國家獸用生物制品工程技術研究中心/江蘇省食品質量與安全重點實驗室,江蘇 南京 210014; 2.獸用生物制品國泰技術創新中心,江蘇 泰州 225300)

重組CTA1-DD蛋白是由霍亂毒素(Cholera toxin,CT)的A1亞基(CTA1)與金黃色葡萄球菌蛋白A的二聚體(D-dimer,DD)相連組成,其佐劑效應于1997年被首次報道。隨后,CTA1-DD被廣泛應用于人類免疫缺陷病毒(HIV)、人乳頭瘤病毒(HPV)、埃博拉病毒(EBOV)、甲型H1N1流感病毒和輪狀病毒小顆粒等疫苗產品中,顯著增強了疫苗的免疫保護效力,驗證了其佐劑功效[1-5]。研究結果表明,CTA1-DD融合蛋白具有與完整CT分子相當的全身性和黏膜佐劑功能,大大提升了機體對與其聯合免疫的特異性抗原的免疫應答水平[6-7],是一種具有前途的蛋白類佐劑。但是,CTA1-DD蛋白在復雜的生理環境中通常容易被酶或者酸降解,生物利用率不高,因此在生產應用中受到很大的限制。

為了解決上述問題,本研究利用載體材料將CTA1-DD蛋白包裹成納米顆粒進行體內遞送,以保護CTA1-DD蛋白在生理環境中不易被快速降解,能夠高效到達靶標組織和細胞,發揮佐劑作用。本研究以同樣具有佐劑活性的多糖(殼聚糖和葡聚糖)衍生物[8-9]為載體材料。殼聚糖是自然界中廣泛存在的甲殼素的脫乙酰產物,分子表面的伯胺基質子化后帶正電,具有良好的生物相容性和生物可降解性[10-11],亦可作為佐劑增強疫苗的體液免疫和細胞免疫應答[12-13]。由于殼聚糖在生理pH下的溶解性較差,研究者常常將殼聚糖通過離子交聯、乳液交聯、自組裝等方法制備成納米顆粒使用[14]。研究結果表明,殼聚糖納米顆?？烧T導炎性細胞因子IL-1β、TNF-α、MCP-1、MIP-1α的釋放,并促進CD4+和CD8+T細胞的增殖[15-17]。Günbeyaz等[18]將殼聚糖納米顆粒用于牛皰疹病毒疫苗的黏膜遞送,提高了細胞免疫水平。Zhao等[19]將新城疫病毒疫苗用殼聚糖納米粒包裹,通過黏膜途徑免疫雞,提升了疫苗的緩釋性、安全性及有效性。葡聚糖的免疫活性調節作用主要與巨噬細胞相關[20]。葡聚糖分子上含有大量羥基,鏈間氫鍵可形成穩定的三級結構,與巨噬細胞表面 Dectin-1和Toll樣受體結合,增強其吞噬活性,并誘導機體炎性細胞因子的釋放,從而間接激活B細胞和T細胞,增強免疫應答[21-22]。

本研究采用葡聚糖的硫酸鹽衍生物和實驗室前期合成的殼聚糖衍生物——O-羧甲基殼聚糖,通過離子交聯法制備包裹有CTA1-DD蛋白的納米顆粒。研究納米顆粒的制備工藝對顆?；拘阅艿挠绊?包裹有CTA1-DD蛋白納米顆粒的包封率和載藥率,并進一步探討包裹有CTA1-DD蛋白納米顆粒的體液免疫和黏膜免疫水平。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

霍亂毒素基因融合蛋白CTA1-DD和O-羧甲基殼聚糖(相對分子質量3×104)均為本實驗室自制,硫酸葡聚糖(相對分子質量5×105)購自索萊寶公司,3,3,5,5-四甲基聯苯胺(TMB)購于博士德公司,其余試劑均購于國藥集團。健康BALB/c雌性小鼠(5周齡)購于揚州大學實驗動物中心。

1.2 O-羧甲基殼聚糖-硫酸葡聚糖(OCS-DS)納米顆粒的制備

分別配制2 mg/ml的O-羧甲基殼聚糖(OCS)和硫酸葡聚糖(DS)溶液,加入NaCl調節其離子強度為0.1 mol/L,0.22 μm濾膜過濾。分別以2 ml的OCS或DS為底液,在高速攪拌條件下,采用注射泵以20 ml/h的流速加入不同體積的反向電荷溶液,再繼續攪拌10 min,靜置6 h后,將樣品倒入離心管中,10 000 r/min離心20 min,棄上清,再用去離子水分散、離心2次,冷凍干燥,4 ℃保存待用。

1.3 包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS納米顆粒制備

將CTA1-DD蛋白以不同終質量濃度加入2 mg/ml的DS溶液中,攪拌溶解,取2 ml為底液。在高速攪拌的條件下,采用注射泵以20 ml/h的流速加入不同體積的OCS溶液(2 mg/ml),再繼續攪拌10 min,靜置6 h后,將樣品倒入離心管中,10 000 r/min離心20 min,棄上清,再用去離子水分散、離心2次,冷凍干燥,4 ℃保存待用。

1.4 包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS納米顆粒的基本性能表征

利用Zetasizer Nano ZS測定單一OCS-DS納米顆粒及包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS納米顆粒的水合粒徑和Zeta電位,利用掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)觀測樣品的本體粒徑和外觀形態。

1.5 包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS納米顆粒的載藥量和包封率評價

將包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS納米顆粒和單一OCS-DS納米顆粒在37 ℃條件下分別攪拌至完全溶解,得到確定納米顆粒質量濃度的澄清溶液。溶液中CTA1-DD蛋白的質量濃度通過BCA試劑盒在570 nm波長下測定吸光度,進一步計算求得。單一納米顆粒溶解液的吸光度值作為空白對照值。OCS-DS納米顆粒對蛋白CTA1-DD的載藥量(DL)和包封率(EE)計算公式分別如下:

DL=(W/Wn)×100%;

EE=(W/W0)×100%。

式中,W:包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS納米顆粒中CTA1-DD蛋白的質量;Wn:包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS納米顆粒中OCS-DS的質量;W0:在包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS納米顆粒制備時CTA1-DD蛋白的投入質量。

1.6 包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS納米顆粒的CTA1-DD蛋白釋放特性評價

將一定質量的包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS納米顆粒和單一OCS-DS納米顆粒分別分散于pH 7.4的PBS緩沖溶液中,在37 ℃的搖床中以54 r/min的速率恒溫振蕩。在不同時間點,各取1 ml振蕩中的PBS溶液,同時補充1 ml新鮮PBS溶液。取出的PBS溶液在4 ℃條件下10 000 r/min離心20 min。取上清液,通過BCA試劑盒測定CTA1-DD蛋白質量濃度,繪制釋放曲線。每個時間點取3個平行樣進行測定,以單一OCS-DS納米顆粒的釋放情況作為對照。

1.7 包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS納米顆粒的佐劑活性評價

以豬偽狂犬病毒(PRV)滅活抗原為模式抗原,與包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS納米顆粒的PBS溶液直接混合制備PRV疫苗,并設置不同對照組。將健康BALB/c雌性小鼠按表1隨機分組,每組8只。PRV疫苗以液滴形式直接涂抹在小鼠的雙鼻孔上,疫苗用量為1只20 μl。首次免疫后21 d,所有小鼠均以相同方式增強免疫1次。首次免疫后42 d,眼眶采血分離血清,并將小鼠處死后收集支氣管肺泡灌洗液,用ELISA法檢測特異性IgG和IgA抗體水平。ELISA檢測法的具體步驟如下:將96孔白板用PRV抗原包被,每孔5 μg,4 ℃孵育過夜,再用含5% BSA的DPBS(每孔100 μl)37 ℃條件下封閉1 h,洗滌,晾干。每孔加入100 μl稀釋后的待測血清(稀釋度:1∶100～1∶12 800)或肺泡灌洗液(稀釋度:1∶20～1∶2 560),37 ℃孵育1.5 h。洗滌5次后,分別加入100 μl的HRP偶聯的山羊抗小鼠IgG抗體(血清樣品檢測孔)或IgA抗體(肺泡灌洗液檢測孔)孵育1 h。洗滌5次,加入100 μl TMB室溫下孵育顯色,15 min后,以2 mol/L的H2SO4(50 μl)終止酶底物反應,檢測450 nm波長下的吸光度值(OD450),判定IgG和IgA抗體滴度。

表1 免疫分組

2 結果與分析

2.1 制備參數對羧甲基殼聚糖-硫酸葡聚糖(OCS-DS)納米顆粒的影響

以O-羧甲基殼聚糖(OCS)為聚陽離子,硫酸葡聚糖(DS)為聚陰離子,二者碰撞過程中可通過離子交聯形成凝膠納米顆粒。由于OCS與DS各自所帶電性的強弱程度不同,因此陰陽離子的碰撞過程中,哪方為過量底物,哪方為漸進增加的成分,二者最終比例都決定了顆粒的結合緊密程度(體現為顆粒粒徑)和顆粒表面的電荷強度(體現為Zeta電位)。此外,顆粒的粒徑還與反向電荷的加入速率、二者結合時的攪拌速率密切相關。

本研究通過前期預備試驗,確定了OCS和DS溶液的質量濃度均為2 mg/ml,反向電荷溶液的加入流速為20 ml/h。重點研究OCS、DS分別為底物時,反向電荷溶液加入比例和二者混合速率這兩個關鍵因素對納米顆粒形成的影響。

由表2可以看出,以聚陰離子DS為底物時,形成的OCS-DS納米顆粒粒徑大部分在250 nm以下,始終保持負電性。隨著反向電荷OCS溶液加入量的增加,顆粒粒徑呈先減少再逐漸增加的趨勢。當反向電荷OCS溶液加入量達到一定值(約1.2 ml左右)時,由于Zeta電位的負電性顯著降低,顆粒間排斥力減少,顆粒粒徑顯著增大,且很快絮凝沉降。隨著顆粒形成時攪拌速率的增加,OCS-DS納米顆粒的粒徑先降低,再趨于一致。顆粒粒徑變化進入平臺期,表明該因素對顆粒粒徑的影響力飽和。

表2 2 ml硫酸葡聚糖(DS)為底物時O-羧甲基殼聚糖-硫酸葡聚糖(OCS-DS)納米顆粒的粒徑與Zeta電位

分析表3結果可知,以聚陽離子OCS為底物時,OCS-DS納米顆粒粒徑大部分在250 nm以上,呈弱正電性。隨著反向電荷DS溶液加入量的增加,顆粒表面正電性越來越弱,粒徑也隨之增加。當二者混合時攪拌速率提高,粒徑略有下降。

綜合表2和表3的顆粒參數來看,以DS為底物制備的OCS-DS納米顆粒,其Zeta電位的絕對值大部分在30以上,表明溶液中顆粒間的排斥力較強,不易團聚。而以OCS為底物制備的顆粒粒徑偏大,Zeta電位絕對值在20左右,穩定性也較差。因此,本研究選擇DS為底物,反向電荷溶液OCS加入量為0.8 ml,攪拌速度800 r/min的制備條件開展后續CTA1-DD蛋白的包裹研究。

表3 2 ml O-羧甲基殼聚糖(OCS)為底物時O-羧甲基殼聚糖-硫酸葡聚糖(OCS-DS)納米顆粒的粒徑與Zeta電位

2.2 包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS納米顆粒的粒徑與電位表征

由于制備的CTA1-DD蛋白整體呈偏弱的負電性,因此將CTA1-DD蛋白加入到聚陰離子DS的溶液中,在CTA1-DD蛋白投入質量濃度分別為0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、1.5 mg/ml、2.0 mg/ml、2.5 mg/ml時制備納米顆粒。制備過程中其他固定參數為:底物為2 ml含不同質量濃度CTA1-DD蛋白的DS溶液(2 mg/ml),注入液為0.8 ml的OCS溶液(2 mg/ml),注入液流速20 ml/h,攪拌速率800 r/min。

由圖1可知,當投入的CTA1-DD蛋白質量濃度≤1.0 mg/ml時,包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS納米顆粒的粒徑和Zeta電位變化不大。隨著投入的CTA1-DD蛋白質量濃度的上升,包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS納米顆粒的粒徑顯示出增加的趨勢,估計是過量的蛋白質未能被充分包裹;而表面電位僅略微下降,表明顆粒表面仍是強烈負電性的葡聚糖硫酸根占主導,弱負電性的CTA1-DD蛋白僅起到輔助作用。

圖1 投入不同質量濃度CTA1-DD蛋白的OCS-DS納米顆粒表征

包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS納米顆粒的微觀外觀如圖2所示,顆粒呈球體,穩定性良好,粒徑為50～150 nm,較之水溶液中測試的粒徑值要小,這是由于OCS-DS納米顆粒在水溶液中的水合半徑較大,而電鏡觀察到的是干燥的本體顆粒。

A:掃描電子顯微鏡結果;B:透射電子顯微鏡結果。

2.3 包裹有CTA1-DD蛋白的納米顆粒的載藥率和包封率

圖3顯示了投入的CTA1-DD蛋白質量濃度分別為0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、1.5 mg/ml、2.0 mg/ml、2.5 mg/ml時,制備得到的包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS納米顆粒有效包封蛋白的能力。由于OCS和DS在發生離子交聯的凝膠化反應時,具有一定負電性的CTA1-DD蛋白也會通過離子作用或隨機碰撞效應嵌入其中。由圖3可知,當CTA1-DD的質量濃度從0.5 mg/ml提高到2.0 mg/ml時,其在OCS-DS納米顆粒上的載藥率也逐漸增加。但是隨著CTA1-DD蛋白質量濃度的增加,則會在納米顆粒形成過程中影響其結合的緊密程度,致使粒徑增大,載藥率反而下降。從包封率來看,CTA1-DD蛋白投入質量濃度為0.5～1.0 mg/ml時,CTA1-DD蛋白的包封率均在80%以上。CTA1-DD蛋白質量濃度進一步增加,載藥率僅小幅提升,但包封率顯著下降。表明大部分CTA1-DD蛋白在溶液中過剩,因此包封率顯著下降。

圖3 投入不同質量濃度CTA1-DD蛋白的OCS-DS納米顆粒蛋白包封能力

2.4 包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS納米顆粒的CTA1-DD蛋白體外釋放特性

依據試驗結果,本研究優選質量濃度1.0 mg/ml的CTA1-DD蛋白投入制備包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS納米顆粒,進行CTA1-DD蛋白體外釋放特性的評價。制備過程中其他固定參數條件不變。包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS納米顆粒在生理pH下的體外釋放過程如圖4所示。納米顆粒在1 d以內有突然釋放效應,釋放約一半的CTA1-DD蛋白。然后在1 d以后釋放速率逐漸變緩即為緩釋過程。第7 d時,預計納米顆粒已基本被水溶液滲透崩解,CTA1-DD蛋白完全釋放。

圖4 包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS納米顆粒的CTA1-DD蛋白體外釋放曲線

2.5 包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS納米顆粒的佐劑活性

為了驗證CTA1-DD蛋白被OCS-DS納米顆粒包裹后的佐劑活性,將包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS納米顆粒與PRV滅活抗原混合后,滴入小鼠鼻腔,并分別設PBS陰性對照、PRV抗原對照及CTA1-DD蛋白對照。首次免疫后42 d,收集血清和肺泡灌洗液,分別檢測代表體液免疫的IgG抗體水平和黏膜免疫的IgA抗體水平。ELISA檢測結果如圖5所示,包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS納米顆粒能夠同時誘導更高的血清IgG抗體和黏膜IgA抗體表達。

a:PBS;b:PRV;c:PRV+CTA1-DD蛋白(5 μg);d:PRV+包裹有CTA1-DD蛋白(5 μg)的OCS-DS納米顆粒;e:PRV+包裹有CTA1-DD蛋白(1 μg)的OCS-DS納米顆粒。*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01);***表示差異極顯著(P<0.001)。

3 討 論

霍亂毒素和與其密切相關的大腸桿菌不耐熱毒素是目前發現的最強大、研究最充分的黏膜佐劑,但由于其具有神經毒性,開發和利用受到限制[23]。經由霍亂毒素A1亞基重組開發的CTA1-DD蛋白規避了神經毒性,并且具有與完整霍亂毒素分子相當的全身和黏膜佐劑功能。但是,在前期的應用中發現,CTA1-DD蛋白在復雜的生理環境中容易被酶或者酸降解,生物利用率不高。為了能夠更好利用CTA1-DD蛋白,讓其在體內能夠盡量多的進入免疫細胞,最大程度發揮其佐劑效應,本研究采取了將其制備成納米顆粒這一策略。

基于CTA1-DD蛋白獨特的黏膜佐劑潛在優勢,本研究選擇了同樣具有黏膜佐劑效應的殼聚糖衍生物為載體材料之一。研究結果表明,無論是殼聚糖分子亦或殼聚糖納米顆粒都在黏膜途徑的疫苗給藥后發揮了顯著的免疫增強作用[12-13,18-19]。然而,殼聚糖僅在強酸性條件下可溶,制備成納米顆粒后一般pH值也偏酸性,預計將限制其在部分抗原上的應用。本研究將殼聚糖6位亞甲基上的羥基選擇性羧甲基化,制得了在廣泛pH下水溶性良好的O-羧甲基殼聚糖,并保留了正電性的伯氨基未被羧甲基化,維持了其陽離子多糖的性能[24]。硫酸葡聚糖是本研究選擇的另一載體材料。葡聚糖通過激活巨噬細胞表面Dectin-1和Toll樣受體,也具備一定的免疫調節功能。而葡聚糖的硫酸化,不但解決了其高分子結構水溶性差的問題,也賦予了葡聚糖表面強烈的負電性。本研究通過正電性的O-羧甲基殼聚糖與負電性的硫酸葡聚糖相互吸引,瞬間交聯形成納米顆粒,制備方法簡單,反應時間短,避免了活性物質因反應時間長或反應條件苛刻而導致的失活。而且制備過程中是在水溶液中進行,除了鹽離子外,沒有添加其他試劑,無毒無害。

本研究篩選了OCS-DS納米顆粒的制備條件,發現以DS為過量底物時,OCS滴加到DS溶液中可以形成比較穩定(Zeta電位絕對值>30)的納米顆粒。隨后又通過細化條件的試驗,確定了包裹CTA1-DD蛋白的制備條件。由于CTA1-DD為弱負電性,所以在制備時與DS溶解在同一水相中,在高剪切力作用下,隨著OCS的滴入,CTA1-DD蛋白隨機嵌入在OCS與DS交聯形成的緊密凝膠三維結構中,理論上應當部分被完全包裹在凝膠內部,部分位于凝膠表面共同維持其結構穩定。

由于CTA1-DD蛋白的二聚體(DD)部分具有一定的B細胞靶向性,而B細胞的激活程度與體液免疫水平直接相關,如果蛋白質完全被包裹在納米顆粒中,則將喪失其靶向作用。本研究將CTA1-DD蛋白納米顆粒與PRV抗原混合制備疫苗,通過鼻腔黏膜途徑免疫小鼠。結果表明,無論是表征全身性體液免疫的IgG抗體還是體現黏膜免疫的IgA抗體,包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS納米顆粒在相同劑量下都能誘導顯著高于CTA1-DD蛋白誘導的抗體水平,直接說明納米顆?；腃TA1-DD蛋白生物利用率更高,佐劑效應更強,同時也間接表明蛋白質的DD部分應該部分展示在納米顆粒表面,仍具有一定的B細胞靶向性。

與傳統免疫途徑相比,黏膜免疫具有免針、降低交叉污染風險等諸多優勢,適當配方的黏膜疫苗可以激活包括分泌性IgA、血清IgG中和抗體及細胞介導的免疫應答在內的任何類型的免疫反應,對易引起黏膜感染或通過黏膜侵入的病原體尤有吸引力[25]。因此,黏膜佐劑的研究對于非活性黏膜疫苗的開發具有重要意義[26]。本研究制備的包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS納米顆粒在初步的小鼠免疫試驗中展現出了高效黏膜佐劑的潛力,后續將進一步明確CTA1-DD蛋白在納米顆粒內部的分布規律,探究CTA1-DD蛋白與納米顆?；プ飨碌拿庖咴鰪妰仍跈C制。