果樹分子標記輔助育種研究進展

孫雨桐, 劉德帥, 馮 美, 齊 迅, 姚文孔

(寧夏大學農學院/寧夏優勢特色作物現代分子育種重點實驗室/林木資源高效生產全國重點實驗室,寧夏 銀川 750021)

果樹育種的常規手段主要有雜交育種、誘變育種、倍性育種等,但由于果樹雜種比較多、品種來源復雜、多為多年生木本植物、生長周期長等因素,導致傳統育種周期長、效率低、不確定因素多。相比于常規育種,分子標記輔助選擇(Molecular marker assisted selection,MAS)可以提高育種效率,縮短育種周期,并且在遺傳多樣性、品種鑒定等方面也有較好的效果[1]。分子標記技術種類繁多,如隨機擴增多態性DNA(Random amplified polymorphic DNA,RAPD)、擴增片段長度多態性(Amplified fragment length polymorphism,AFLP)、簡單序列重復(Simple sequence repeat,SSR)、單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphism,SNP)等,這些分子標記被廣泛應用于果樹的遺傳育種、親緣關系判斷、遺傳圖譜構建以及數量性狀座位(QTL)定位等研究中。這將加速果樹品種的改良進程,提高育種效率。

1 果樹上應用分子標記的主要類型

1.1 RAPD分子標記

為適應不良環境以及抵御病蟲危害,培育具有一定抗性的果樹品種至關重要。Tartarini[2]從5種不同的RAPD標記中篩選出與MdVf基因緊密相關的OPAM192200和OPAL07580,標記了蘋果(Malusdomestica)抗赤霉病Vf基因。楊亞州等[3]以燕山葡萄和河岸葡萄的F1代為材料,通過7個RAPD標記對其抗旱性進行研究,將RAPD標記5226-1100轉化成專一性的SCAR(Sequence characterized amplified regions,特定序列擴增)標記DR-760。其次RAPD分子標記多用于果樹遺傳多樣性及品種鑒定,余智城等[4]對16份柑橘包括11份琯溪蜜柚進行遺傳多樣性分析,通過15條RAPD引物將16份材料分為2大類(表1)。

表1 隨機擴增多態性DNA(RAPD)分子標記在果樹上的應用

1.2 AFLP分子標記

分析果樹遺傳多樣性,有助于果樹的分類。董美超等[9]針對90份鱷梨品種材料從24對AFLP引物中篩選出8對進行遺傳多樣性分析,根據遺傳相似系數可劃分為4個類群。Lai等[10]采用AFLP和甲基化敏感擴增多態性(Methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)的分子標記技術探究車道晚臍橙與芽變南瓜狀臍橙之間的基因和基因組甲基化差異,結果表明芽變南瓜狀臍橙的出現是由于基因突變?？梢夾FLP結合MSAP分子標記技術可以研究橙的早熟及果實形狀的基因突變,這為此方面其他果樹的研究提供了理論及技術的支持(表2)。

表2 擴增片段長度多態性(AFLP)分子標記在果樹上的應用

1.3 SSR分子標記

SSR標記的優點是大量標記及其共顯性遺傳,也正因如此SSR分子標記被廣泛應用在果樹育種中。王立新等[15]從144對SSR引物中篩選出3對引物對40份蘋果進行檢測,結果表明,這3對引物可以鑒定區分40份蘋果。Kimura等[16]用9個SSR標記鑒別60個亞洲梨品種,研究結果表明其中7個SSR標記能將58個品種區分開。劉國彬等[17]以19種歐李種質及其近緣種杏李、李資源為試驗材料,利用SSR標記進行品種鑒定并構建分子身份證。魏姍姍等[18]以95份桃品種為試材,利用18對SSR引物對桃進行遺傳多樣性分析,發現了桃品種的8個連鎖群。胡光明等[19]以紅陽獼猴桃為材料,從435對SSR引物中篩選出67對引物,用于獼猴桃屬種質資源的親緣關系及遺傳多樣性分析。Mahjbi等[20]以20個突尼斯柑橘品種為材料,通過7個SSR位點建立了它們的親緣關系來探究其遺傳多樣性。此外SSR分子標記也被用于果樹品質育種、抗性育種以及遺傳圖譜構建(表3)。

表3 簡單序列重復(SSR)分子標記在果樹上的應用

1.4 SRAP分子標記

相關序列擴增多態性(Sequence related amplified polymorphism,SRAP)標記與RAPD標記的原理和步驟極為相似,但SRAP相對于RAPD,穩定性高,重復性好,多態性較高。董星光[27]以黃冠和鴨梨為試材,用SRAP和AFLP標記對其抗病基因進行分析,發現與抗黑星病相關的1條SRAP標記和1條AFLP標記,可見SRAP與AFLP可聯合用于梨的抗病品種的選育。馮濤等[28]以小白桃、津柳早紅為試材,用12條SRAP引物對其早熟基因進行分析,結果表明SRAP標記可以用于鑒定桃成熟期芽變(表4)。

表4 相關序列擴增多態性(SRAP)分子標記在果樹上的應用

1.5 SCAR分子標記

測序的擴增區段(Sequence characterized amplified region, SCAR)標記最初是從RAPD分子標記技術衍生而來的,并且重復性和特異性比RAPD更好。為減少農藥對環境和人體的危害,選育抗病品種具有重要意義,SCAR分子標記在果樹抗病育種方面發揮著重要的作用。祁楠等[33]以秦冠和富士F1代群體為試材,將蘋果抗斑點落葉病相關基因的1個RAPD標記轉換為SCAR標記(表5)。Deng等[34]以柑橘為材料克隆并測序了20個與抗柑橘三葉草病毒基因連鎖的RAPD片段中的7個,并將它們轉化為SCAR標記。趙偉[35]以用8種葡萄作為親本的雜交后代為材料,用SCAR標記SCO11-914對其白粉病抗性進行檢測。

表5 測序的擴增區段(SCAR)分子標記在果樹上的應用

1.6 SNP分子標記

SNP檢測方法主要有酶切擴增多態性序列(CAPS)、單鏈構象多態性(SSCP)、直接測序和基因芯片等。Baldi等[38]通過2個蘋果品種Fiesta和Discovery之間雜交的分離群體開發CAPS和SSCP標記,標記其抗性基因的定位,實現了克隆序列的遺傳作圖。SNP多用于遺傳圖譜的構建。Antanaviciute等[39]使用來自28種海棠基因型的SNP數據為海棠開發了全基因組基因分型陣列。該陣列為任何給定的海棠后代提供了高通量基因分型和連鎖圖譜開發的前景。將2 272個SNP標記的數據整合到M432子代的圖譜中,并展示了最完整和最飽和的普米拉分枝桿菌17個連鎖群的圖譜。唐海霞等[40]以冬棗和金絲4號的F1代103株群體為材料,用簡化基因組測序技術(GBS)開發的SNP構建了1張包含12條連鎖群的遺傳圖譜。相關研究(表6)為果樹數量性狀定位、功能基因挖掘以及圖位克隆等研究提供了有效的理論依據。

表6 單核苷酸多態性(SNP)分子標記在果樹上的應用

2 果樹遺傳圖譜構建概況

分子標記已被廣泛用于構建遺傳圖譜,遺傳圖譜是基于遺傳距離的圖譜,它反映的是不同基因座之間的遺傳距離和連鎖程度。目前,大量分子標記如SNP、SCAR、SSR、AFLP、SRAP等被用于果樹遺傳作圖。Wu等[44]以八月紅和碭山酥梨雜交的102個梨F1代單株為作圖群體,用SNP與SSR整合構建了梨的高密度連鎖圖譜,該圖譜是用快速和穩健的限制性相關DNA測序技術(RADseq)繪制的。連鎖圖譜由SNP標記和SSR標記組成,共3 241個標記,跨度為2 243.4 cM,平均標記距離為0.70 cM。劉更森[45]以富士和金冠雜交的F1代122個單株為作圖群體,選用已開發的SNP,結合SSR標記構建了蘋果遺傳圖譜。以杧果金黃和貴妃雜交的98株F1代植物為作圖群體,用SRAP、AFLP和ISSR分子標記進行作圖,該圖譜由33個連鎖群組成,總遺傳距離為1 561.1 cM[46]。已構建遺傳圖譜的果樹品種見表7。

表7 果樹遺傳圖譜構建概況

3 QTL基因定位在果樹育種中的應用

通常沒有一種基因能唯一決定某些性狀,一般一組基因作為一個整體控制著某一特性。與特定數量性狀相關的基因所在的基因組區域稱為QTL,即數量性狀位點。自從分子標記出現以來,研究人員和育種人員一直致力于識別與這些QTL相關的功能標記,在果樹的重要性狀QTL定位和分子標記輔助育種等方面均取得較好的成果,如果樹生長發育、果實的品質、抗逆性的強弱等。前人已對蘋果、梨、柑橘等多種果樹的生長發育特性(開花、生根能力、矮化等)、果實品質(質量、大小、顏色、硬度、風味等)、抗生物脅迫、抗非生物脅迫(耐鹽堿、抗干旱、抗寒等)等重要農藝性狀進行分析,有助于培育特定目標性狀的果樹品種。

3.1 與蘋果相關的QTL

蘋果QTL的鑒定集中于其主要農藝性狀[如矮化、果實品質(包括果實質量、果實大小、果實顏色以及果肉的糖酸含量)、蘋果的抗逆性(抗寒、抗旱、耐鹽堿等)]。Foster等[62]對41份M93Robusta5(非矮化)與Braeburn接穗嫁接的砧木群體的QTL進行分析,結果表明,連鎖群LG5上的一個主要QTL對接穗的矮化有顯著影響。Zheng等[63]用來自海棠、紅富士、金冠、喬納森家系9 422株蘋果F1代雜交種為試材,檢測得到9個與蘋果果皮顏色遺傳變異有關的微效QTL(表8)。孫瑞[64]以紅玉、金冠以及紅玉和金冠的F1代雜交群體297株蘋果為試材,對其品質性狀進行QTL定位,共得到12個QTL位點。

3.2 與梨相關的QTL

迄今,QTL定位在梨的研究上取得了一定的成果。趙亞楠[65]利用蘋果梨和八月紅150株F1代材料對14個果實品質性狀進行基因定位分析,共獲得28個QTL位點,其中與單果質量相關的QTL位點有5個、與果心大小相關的QTL位點有2個、與果肉硬度相關的QTL位點有3個、與果實橫徑相關的QTL位點有6個、與果梗長度相關的QTL位點有1個、與可溶性固形物含量相關的QTL位點有6個、與可滴定酸含量相關的QTL位點有2個,共掃描到2 266個基因。Sun等[66]以131個亞洲梨和歐洲梨為試驗材料,在已被鑒定的病害相關QTL區域中找到41個核苷酸結合位點(NBS)編碼基因(表9)。

表9 梨相關的數量性狀座位(QTL)

3.3 與柑橘相關的QTL

通過分子標記構建柑橘的遺傳連鎖圖譜可以獲得果實發育等農藝性狀和應答逆境脅迫的QTL。羅艾等[72]以晚蜜2號和梨橙2號的94株F1代材料為群體,進行QTL定位分析,發現4個與果實質量相關的QTL定位,7個與果實大小相關的QTL定位。馬喜軍[73]以晚蜜2號和梨橙2號的350株F1代為試驗材料對柑橘抗寒性相關的QTL進行定位,得到7個與柑橘抗寒性相關的QTL,分布于4個連鎖群上,分別為LW1、LW2、LW3和LW8。Huang等[74]對甜橙×枳橙屬間雜交的170株F1代進行基因分型分析,在枳遺傳圖譜上鑒定到4個與柑橘黃龍病相關的QTL(表10)。

表10 柑橘相關的數量性狀座位(QTL)

3.4 與其他果樹相關的QTL

除常見果樹外,其他果樹重要性狀相關的QTL定位研究也取得了很大進展。Cirilli等[79]評估133份桃種質,定位到1個可以推遲桃花期的QTL。鮑荊凱[80]用JMS2和交城5號棗的150株F1代材料對其QTL定位進行分析,共獲得104個QTL位點,其中與果實大小相關的QTL位點57個、與果實糖組分相關的QTL位點17個、與果實酸組分相關的QTL位點30個。劉春燕[81]以桂海4號和山梨獼猴桃的雜交后代開展QTL定位研究,共檢測到44個QTL位點,其中與果實質量相關的QTL位點7個,與果實橫縱徑相關的QTL位點21個。史曉暢[82]以山東大綿球和新賓軟籽山楂的130株雜交F1代為材料,檢測到2個與單果質量相關的QTL位點,6個與果皮穿刺硬度相關的QTL位點,3個與果實大小相關的QTL位點,5個與果皮脆性相關的QTL位點,5個與果肉平均硬度相關的QTL位點。這些研究(表11)不僅豐富了果樹的遺傳學研究,也為果實品質及果樹抗逆的遺傳機制和育種研究提供了理論基礎。

4 展 望

在果樹的品種鑒定、輔助育種(早熟、無核、矮化、品質以及抗性等)、遺傳圖譜的構建和農藝性狀基因定位等方面,DNA分子標記被廣泛應用。DNA分子標記技術種類多樣,大致可分為三類。第一類:以電泳技術和分子雜交技術為核心的分子標記技術,如RFLP;第二類:以DNA聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction,PCR)為基礎的分子標記技術,包括RAPD、SSR、SCAR等;第三類:以DNA測序為核心的分子標記技術,如SNP標記[83]。RFLP具有共顯性且不需要先驗序列信息,但它耗時長,需要大量純DNA,價格也比較昂貴[84]。RAPD操作簡單,所需DNA量少,多態顯性,但需要高度純化的DNA并且再現性低。DNA的數量和質量、PCR緩沖液、氯化鎂濃度、退火溫度和TaqDNA聚合酶是影響RAPD標記再現性的一些重要因素[85]。AFLP標記將RFLP和PCR技術結合在一起,先對DNA進行消化,然后進行PCR。AFLP標記物具有低成本,并且不需要先前的序列信息。在AFLP中,既可以使用高質量的DNA,也可以使用部分降解的DNA,但是,該DNA不能含有任何限制性內切酶或PCR抑制劑[86]。相較于RFLP、RAPD、AFLP等分子標記,SSR標記具有多態性檢出率高、基因組中分布廣泛、結果穩定可靠等特點,是檢測品種真實性、分析品種間遺傳差異以及鑒定純度的理想標記[87]。SNP可以提供最簡單和最大數量的標記。SNP在植物和動物中大量存在[88-91],植物中的SNP頻率為每100～300 bp中有1個SNP。SNP成本低,在基因組中廣泛分布,無需先驗序列信息,再現性高,共顯性標記,但其開發成本較高。人們基于不同的等位基因識別技術和檢測平臺已經開發了大量的SNP基因分型方法,其中,RLFP(SNP-RFLP)是最簡單的方法,CAPS標記技術也可以應用于SNP檢測[92]。分子標記種類繁多,功能優勢也有所不同,根據試驗的目的選擇合適的分子標記有助于解決具體問題。

表11 與其他果樹相關的數量性狀座位(QTL)

為同時提高育種效率、縮短育種周期,尋找與農藝性狀密切相關的分子標記至關重要。分子標記輔助育種(MAS)的優勢可以體現在以下3個方面。一、允許提前選擇。在育種中,有些性狀需要特定的生長環境和一定的生長周期。二、同一性狀利用多個等位基因。在不同的育種材料中,可能存在多個基因影響同一性狀(如抗病性和品質),利用表型很難識別這些等位基因。三、允許同時選擇多個性狀。所選單株或品系不僅要在單株抗病、品質、產量等方面表現良好,綜合性狀也要相對較好。因此,有必要對育種的種群中每個目標性狀逐一進行識別和篩選。以往的研究大多將目的基因的分子標記與育種工作分離,不能很好地應用于實際。今后分子標記技術的發展將與傳統育種相結合,使其盡快為育種工作服務。這有助于提高果樹作物育種效率,加快育種發展進程。