六味地黃湯對老化模型大鼠視網膜組織鐵死亡通路的影響

張 琦,趙 磊,左 韜

0 引言

隨著年齡的增長,機體會出現不可逆的衰老性改變,眼球是較早發生與年齡相關的退行性改變的器官之一,如視網膜衰老是年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration,ARMD)的重要病因之一[1],如能減緩視網膜的衰老,就可以從源頭上減少ARMD等年齡相關性眼病的發病率或減慢其病程進展[2]。鐵死亡(ferroptosis)是一種程序性細胞死亡,以脂質過氧化、鐵積累為特征[3],在衰老及其相關病理過程中發揮著重要調控作用,這也是衰老研究領域出現的嶄新突破口,極大地推動了對于衰老及其相關疾病調控機制的深入研究。鐵死亡相關調控分子同樣對于衰老進程存在一定的調控作用。因此,本研究基于鐵死亡途徑研究六味地黃湯對老化模型大鼠視網膜的保護作用機制。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物選取7-8周齡SPF級雌性SD大鼠45只,體質量200±20 g,購自遼寧長生生物技術股份有限公司[許可證編號:SCXK(遼)2020-0001]。飼養于SPF級實驗室,屏障通風循環良好,室溫20-25 ℃,濕度45%-55%,光照12 h/d。實驗遵循相關規定,并通過動物實驗倫理審查[批件號:2023CS(DW)-003-01],大鼠飼養期間均受人道對待。

1.1.2主要試劑及儀器

1.1.2.1主要試劑D-半乳糖(國藥集團化學試劑有限公司,63004434),復方托吡卡胺滴眼液(沈陽興齊眼藥股份有限公司,H20055546),谷胱甘肽(glutathione,GSH) ELISA檢測試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司,YJ531010)、鐵蛋白(ferritin,FE) ELISA檢測試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司,YJ003262),兔抗鼠溶質載體家族7成員11(recombinant solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)抗體(上海優寧維生物科技股份有限公司,12691),兔抗鼠谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase4,GPX4)抗體(美國proteintech公司,67763-1-Ig)、兔抗鼠色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)抗體(武漢云克隆科技股份有限公司,PAB972Ra01),β-actin 抗體(美國SAB公司,21338)。

1.1.2.2主要儀器體表檢測儀(東莞市微視康電子科技有限公司),石蠟包埋機(浙江益迪儀器有限公司,YD-6L),石蠟切片機(Leica,RM2245),石蠟冷凍臺(浙江益迪儀器有限公司,YD-6D),攤片機(浙江益迪儀器有限公司,YD-A),烤片機(浙江益迪儀器有限公司,YD-B),普通光學顯微鏡(Nikon,Eclipse Ci-L),垂直電泳槽(BIO-RAD,JY-ZY5),化學發光成像系統(Tanon,5200Multi),多功能全波長酶標儀(BioTek,Epoch)。

1.1.3藥品制備六味地黃湯組成為熟地黃24 g,山茱萸、山藥各12 g,茯苓、澤瀉、牡丹皮各9 g,均購自遼寧省中醫院草藥局,將藥材用相當于藥材5倍自來水浸泡2 h,武火煮沸后文火繼續煎煮30 min,過濾收集煎液,原藥渣加少量水繼續煎煮,得二煎液;兩煎液混合,濃縮至濃度生藥含量為1 g/mL[4]。成人(60 kg)口服六味地黃湯的劑量為1.25 g/(kg·d)。通過人與大鼠等效劑量換算公式換算大鼠經口灌服六味地黃湯等效劑量為6.75 g/(kg·d)。

1.2方法

1.2.1模型建立及分組將45只大鼠適應性飼養7 d后,隨機分成空白組(n=15)、模型組(n=15)、中藥組(n=15)。模型組、中藥組復制老化模型,即腹腔注射D-半乳糖[500 mg/(kg·d)],連續注射8 wk[5];空白組腹腔注射生理鹽水[500 mg/(kg·d)]。同時,中藥組灌服六味地黃湯[6.75 g/(kg·d)],空白組、模型組灌服等體積生理鹽水,連續8 wk。

1.2.2眼底彩照及圖像分析末次給藥后2 h對各組大鼠行眼底彩照。具體方法:各組大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后散瞳(復方托吡卡胺滴眼液點眼,每次5-10 min,共3次),將體表檢測儀鏡頭對準瞳孔,調整距離使電腦屏幕中眼底圖片清晰,調整鏡頭角度,視盤位于屏幕中央,對焦后拍照。在MATLAB平臺上運行視網膜自動圖像分析(automated retinal image analyzer,ARIA)軟件測量各組大鼠視網膜血管管徑。在ARIA軟件中打開以視盤為中心的大鼠眼底彩照圖片,對距視盤邊緣0.5-1.0個視盤直徑范圍內的所有血管進行自動分析,見圖1。手動剔除不合格血管,按照血管直徑由大到小的順序將動脈和靜脈分別排序,選取較粗的動脈和靜脈各6條,分別將管徑代入修正后的Parr-Hubbard公式[6]計算視網膜中央動脈管徑當量(central retinal artery equivalent,CRAE)、視網膜中央靜脈管徑當量(central retinal vein equivalent,CRVE)。

圖1 ARIA軟件操作界面。

1.2.3HE染色采用HE染色法檢測各組大鼠視網膜病理形態及厚度。大鼠實施安樂死后摘除右眼,FAS眼球固定液固定24 h以上,石蠟包埋,連續切片(厚度為4 μm),蘇木素-伊紅(HE)染色,應用光學顯微鏡觀察視網膜形態,并采用Image J軟件測量視神經旁2 mm處各層視網膜厚度。

1.2.4免疫組織化學染色采用免疫組織化學染色法檢測各組大鼠視網膜組織中PEDF、SLC7A11、GPX4的表達。取石蠟切片,脫蠟,抗原修復液水浴20 min(100 ℃),取出放涼,PBS緩沖液洗滌3次,加3% H2O2,山羊血清封閉10 min,加一抗工作液(稀釋比例1∶300)。隔日,4 ℃冰箱中取出后PBS緩沖液洗滌5次。加二抗工作液(稀釋比例1∶500),水浴90 min(37 ℃)。重復沖洗過程,滴加DAB顯色液,再次沖洗,蘇木素復染(30-60 s),1%鹽酸乙醇分化,自來水充分沖洗。晾干后中性樹脂封片,采集并儲存圖像。

1.2.5Westernblot法采用Western blot法檢測各組大鼠視網膜組織中PEDF、SLC7A11、GPX4的表達。大鼠實施安樂死后摘除右眼,解剖顯微鏡下將眼球沿角鞏膜緣剪開,摘除玻璃體,內皮針固定,慢慢剝離出視網膜后將其剪碎、勻漿,裂解30 min。4 ℃、12 000 r/min離心5 min,取上清液,進行蛋白定量,上樣行SDS-PAGE電泳,轉膜,加入100 g/L脫脂奶粉后室溫封閉1 h,加入一抗(稀釋比例1∶1000),4 ℃孵育過夜,洗滌,加入二抗(稀釋比例1∶1000),室溫孵育1 h,ECL發光與膠片曝光,掃描膠片,以β-actin為內參照物,測定目的條帶、β-actin的灰度值,計算出兩者的比值即該樣本所測目的蛋白的相對表達水平。

1.2.6ELISA法ELISA法檢測各組大鼠視網膜組織中鐵蛋白、GSH的表達。取視網膜組織上清液,按照試劑盒說明書檢測各組大鼠視網膜組織中鐵蛋白、GSH表達水平,用酶標儀測定450 nm處吸光度。制作標準曲線,按照標準曲線的公式,計算其與BCA蛋白濃度的比值。

2 結果

2.1各組大鼠眼底彩照及圖像分析空白組大鼠眼底呈淡紅色,自視盤向周圍發出均勻的大血管,分支良好且延伸到視網膜周圍;模型組大鼠較空白組視網膜變白,血管增多、收縮;中藥組大鼠較空白組眼底顏色略變白,血管略有收縮,見圖2A-C。與空白組相比,模型組、中藥組大鼠CRAE、CRVE變小(P<0.05);與模型組相比,中藥組大鼠CRAE、CRVE變大(P<0.05),見表1,圖2D。

圖2 各組大鼠眼底彩照及圖像分析 A:空白組;B:模型組;C:中藥組;D:各組大鼠CRAE和CRVE改變情況。白色箭頭:視網膜變白;黃色箭頭:視網膜血管收縮。aP<0.05 vs 空白組;cP<0.05 vs 模型組。

表1 各組大鼠CRAE和CRVE情況

2.2各組大鼠視網膜形態及厚度變化HE染色結果顯示,空白組大鼠視網膜層次清晰,細胞排列整齊;模型組大鼠較空白組視網膜變薄,外核層(outer nuclear layer,ONL)、內核層(inner nuclear layer,INL)細胞減少;中藥組大鼠較空白組視網膜略變薄,ONL、INL細胞略減少,見圖3A-C。測量視神經旁2 mm處視網膜厚度,與空白組相比,模型組、中藥組大鼠視網膜厚度、INL厚度、ONL厚度均變薄(P<0.05);與模型組相比,中藥組大鼠視網膜厚度、INL厚度、ONL厚度均增厚(P<0.05);三組大鼠INL厚度占視網膜厚度百分比、ONL厚度占視網膜厚度百分比比較差異均無統計學意義(P>0.05),見表2,圖3D。

圖3 各組大鼠視網膜HE染色情況 A:空白組;B:模型組;C:中藥組;D:各組大鼠視網膜厚度改變情況。INL:內核層;ONL:外核層。aP<0.05 vs 空白組;cP<0.05 vs 模型組。

表2 各組大鼠視網膜厚度改變

2.3各組大鼠視網膜組織中PEDF和SLC7A11及GPX4蛋白表達水平免疫組織化學染色結果顯示,與空白組比較,模型組大鼠視網膜組織中PEDF、SLC7A11、GPX4蛋白表達程度降低(P<0.05),中藥組大鼠視網膜組織中PEDF、SLC7A11、GPX4表達程度降低(P>0.05);與模型組比較,中藥組大鼠視網膜組織中SLC7A11、GPX4表達程度增高(P<0.05),PEDF表達程度略有增高(P>0.05),見圖4、5,表3。PEDF于INL表達相對明顯,SLC7A11于視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)層表達相對明顯,GPX4于ONL表達相對明顯,證明視網膜在衰老中的不均等性,說明RPE、ONL是衰老視網膜發生鐵死亡的關鍵部位。

圖4 免疫組織化學染色法檢測各組大鼠視網膜組織中相關蛋白表達情況 INL:內核層;ONL:外核層;RPE:視網膜色素上皮。綠色箭頭示PEDF/SLC7A11/GPX4蛋白陽性表達。

圖5 免疫組織化學染色法檢測各組大鼠視網膜組織中相關蛋白表達水平 aP<0.05 vs 空白組;cP<0.05 vs 模型組。

表3 免疫組織化學染色法檢測各組大鼠視網膜組織中相關蛋白表達水平

Western blot檢測結果顯示,與空白組比較,模型組、中藥組大鼠視網膜組織中PEDF、SLC7A11、GPX4蛋白相對表達水平均降低(P<0.05);與模型組比較,中藥組大鼠視網膜組織中PEDF、SLC7A11蛋白相對表達水平均升高(P<0.05),GPX4蛋白相對表達水平略有升高(P>0.05),見圖6,表4。

圖6 Western blot法檢測各組大鼠視網膜組織中相關蛋白相對表達情況 A:Western blot檢測結果;B:Western blot檢測量化分析結果,aP<0.05 vs 空白組;cP<0.05 vs 模型組。

表4 Western blot法檢測各組大鼠視網膜組織中相關蛋白相對表達水平

2.4各組大鼠視網膜組織中鐵蛋白和GSH表達水平ELISA檢測結果顯示,與空白組比較,模型組大鼠視網膜組織中GSH表達降低(P<0.05),中藥組大鼠視網膜組織中GSH表達略有降低(P>0.05),模型組、中藥組大鼠視網膜組織中鐵蛋白表達均增高(P<0.05);與模型組比較,中藥組大鼠視網膜組織中GSH表達增高(P<0.05),鐵蛋白的表達略有降低(P>0.05),見表5,圖7。

圖7 ELISA法檢測各組大鼠視網膜組織中鐵蛋白和GSH表達水平 aP<0.05 vs 空白組;cP<0.05 vs 模型組。

表5 ELISA法檢測各組大鼠視網膜組織中鐵蛋白和GSH表達水平

3 討論

半乳糖可致全身各系統發生氧化應激和線粒體損傷,模擬自然衰老大鼠所發生的改變,是成熟的用于誘導動物老化模型的藥物[7]。關萍等[8]研究表明,小鼠連續49 d頸背部皮下注射D-半乳糖[5.12 mg/(g·d)]相當于自然生長的21月齡小鼠。根據公式9.125×小鼠日=1人類年[9]計算,此法誘導衰老小鼠相當于人類69歲。雖然本研究為大鼠,但根據小鼠衰老程度推斷,本研究中造模方法可以達到大鼠的高度衰老期。衰老和氧化應激是ARMD的重要病因[10],與碘酸鈉注射致ARMD模型相比,以D-半乳糖誘導的亞急性衰老動物模型用于研究ARMD,同時還兼具了衰老的因素,更符合ARMD的實際病理情況,因此該模型亦可作為ARMD模型[11]。年老體弱,肝腎不足,精血無以上注于目,視衣失養,神光不得發越,本方中熟地、山茱萸、山藥可滋補肝腎。黃斑是視力最敏銳的地方[12],是目中神光發越的源泉[13]。學者邱禮新、陳達夫、李傳課皆認為黃斑屬脾[14-16],然本方山藥、茯苓可補脾益氣。楊華杰等[17]通過網絡藥理學及實驗驗證了六味地黃丸具有延緩衰老的作用。研究表明,鐵死亡能夠調控衰老進程,由此本研究提出假說,即基于調控鐵死亡研究六味地黃湯對老化模型大鼠視網膜的保護作用機制。

對于D-半乳糖誘導的老化模型大鼠視網膜衰老程度的模型評價主要包含:(1)眼底彩照觀察眼底。本研究結果顯示,模型組大鼠視網膜變白,血管增多、收縮,與方越等[18]和董偉華等[19]研究中ARMD大鼠模型眼底彩照表現相近。ARIA軟件是一個免費的開源軟件,可自動識別血管并分析其平均直徑,具有良好的重復性和再現性[20]。本研究結果顯示,模型組大鼠視網膜CRAE、CRVE均變小,與王爽等[21]研究中老年人視網膜血管直徑5 a變化的隊列研究得出的結論一致,說明隨著年齡的增長,視網膜動靜脈血管均出現逐漸變細的趨勢。(2)HE染色檢測視網膜病理形態及厚度。本研究結果顯示,模型組大鼠視網膜總厚度及INL、ONL厚度均明顯變薄,但INL、ONL厚度占視網膜總厚度的構成比基本不變,與孫兆霞等[22]研究結果一致,說明衰老引起大鼠視網膜總厚度及各層厚度不同程度的變薄。(3)免疫組織化學染色法和Western blot法檢測視網膜組織中PEDF的表達。結果顯示,模型組大鼠視網膜組織中PEDF表達下調。PEDF廣泛表達于眼、腦等組織中[23]。眼內PEDF主要由RPE以旁分泌的方式分泌至感受器間質[24],在視網膜分化中發揮重要作用。PEDF被稱為“年輕”蛋白質,其原因是老年人較青年人視網膜中PEDF表達明顯下調[25],或致視網膜發生與衰老相關的變化。PEDF降低可能是RPE氧化損傷和年齡增加的直接結果[26]。以上均說明老化模型大鼠視網膜衰老造模成功。經六味地黃湯治療后,中藥組較模型組上述模型評價指標均得到一定的改善,說明六味地黃湯對緩解視網膜衰老起到一定的作用。

本研究結果表明,模型組較空白組大鼠視網膜組織中鐵蛋白表達增高(P<0.05),GSH、SLC7A11、GPX4表達降低(P<0.05)。近年提出鐵衰老概念,即認為衰老和鐵積累之間存在惡性循環[27]。鐵蛋白與體內儲存鐵含量呈正比。隨著年齡的增長鐵會逐漸積累[28],鐵穩態的失衡與年齡相關疾病存在關聯。與年輕人相比,老年人體內的鐵水平增加2倍[29],RPE內的鐵水平增加3倍[30],視網膜內的鐵水平增加1.3倍[31]。因鐵超負荷而產生氧自由基可以引起視網膜毒性,鐵通過Fenton反應催化生成不穩定的羥自由基,參與多不飽和脂肪酸的脂質氧化,產生共軛二烯,導致生成脂質過氧化產物,使細胞功能減退,促發鐵死亡。SLC7A11是調控“鐵過載-鐵死亡”的關鍵基因,鐵離子通過ROS-Nrf2-ARE軸上調SLC7A11的表達,SLC7A11能抑制鐵過載引發的鐵死亡[32]。鐵死亡的主要下游調控因子GPX4是鐵死亡的“門控蛋白”,是鐵死亡研究領域的明星分子。GPX4通過將脂質氫過氧化物轉變為類脂醇,抑制脂質活性氧的形成,從而減輕脂質過氧化,抑制細胞鐵死亡的發生。因此,GPX4含量降低會使細胞脂質過氧化水平增加,進而發生鐵死亡[33]。GSH是GPX4催化反應的底物,GSH耗盡引起GPX4失活,造成活性氧(ROS)積累,誘導鐵死亡。細胞內GSH和GPX4水平均受SLC7A11影響[34]。本研究結果表明,中藥組較模型組大鼠視網膜組織中GSH、SLC7A11表達增高(P<0.05),說明六味地黃湯可通過影響老化模型大鼠視網膜組織中GSH、SLC7A11的表達調控鐵死亡途徑進而達到保護視網膜老化的目的。

作用于鐵死亡的藥物有望成為防治視網膜老化的新方案。質膜喪失完整性、細胞質和細胞器腫脹、染色質濃縮是鐵死亡的形態學特征,在超微結構水平表現為線粒體萎縮、嵴減少或消失、膜密度增加[35],因此,未來研究會應用透射電子顯微鏡觀察老化模型大鼠視網膜的超微結構變化情況,進一步從形態學角度證實視網膜老化與鐵死亡的相關性。