基于微環境調控的脊髓損傷修復策略及相關研究進展

張羽 竇榮聲 閆浩 楊森 王炳武

脊髓損傷(SCI)是指高能量沖擊下脊柱和脊髓生理連續性中斷或破壞,脊髓神經回路中斷,使得損傷平面以下肌肉癱瘓、感覺喪失及自主神經功能障礙,嚴重時甚至會危及生命。目前,全球SCI患者超過300萬人;每年大約有18萬新增病例,然而,國內外對發生SCI的患者尚無有效的治療方法,這給患者的生理和心理帶來了沉重的負擔[1,2]。盡管在過去的幾十年里,脊髓損傷患者的存活率穩步上升,但脊髓損傷個體的死亡率仍然大大超過無脊髓損傷的同齡對照組。脊髓損傷的神經預后主要取決于脊髓損傷的初始嚴重程度,及時的醫療和外科護理可減少繼發性損傷的影響。與外周神經系統不同,脊髓屬于中樞神經系統。其中,血脊髓屏障(blood-spinal cord barrier,BSCB)在脊髓損傷病程進展中起著重要作用,BSCB在功能上相當于血腦屏障,為脊髓的細胞成分提供了一個專門的微環境,對脊髓實質起著保護和調節作用,SCI后 BSCB遭到破壞,脊髓微環境中原本的平衡狀態被打破,進而發生一系列病理生理變化,出現嚴重出血和缺氧缺血癥狀[3]。SCI后微環境中存在的抑制因子會影響內源性干細胞的分化,促進內源性干細胞向更多星形膠質細胞分化[4]。神經干細胞與神經元的比例失調會直接影響SCI的恢復,內源性干細胞的神經元數量不足以重建突觸和神經圈,且星形膠質細胞大量存在會促進損傷部位形成一個厚厚的疤痕,對脊髓的正常功能產生不可逆轉的后果[5]。因此,為了促進脊髓損傷后修復,研究者們逐漸將目光轉移至SCI產生的復雜微環境的調控上來。近年來,隨著對脊髓損傷病理機制的研究取得了一系列進展,特別是隨著基因調控、細胞測序、細胞示蹤等技術的發展,對SCI微環境的深入探索變得更加可行,并且有些已經取得了很好的治療效果。因此,基于微環境調控的脊髓損傷修復策略前景廣闊。

1 SCI后脊髓微環境的變化

微環境失衡是指組織、細胞和分子在不同時間和空間中抑制因子的增加和促進因子的減少。在組織水平上表現為出血、缺血、膠質瘢痕形成、脫髓鞘和再髓鞘形成的不平衡。細胞水平則涉及內源性干細胞分化和小膠質細胞和巨噬細胞轉化表型的失衡。分子水平包括神經營養因子及其前肽、細胞因子和趨化因子的失衡。SCI的病理生理可分為兩類：原發性損傷和繼發性損傷[6]。原發性損傷中以創傷性脊髓損傷最為常見,通常由外部物理沖擊引起,如車禍、摔傷導致的急性牽張、剪切、壓迫或橫斷。非創傷性脊髓損傷多是由腫瘤、退行性病變、局部缺血或先天性疾病所引起[7]。創傷性脊髓損傷后幾分鐘內發生的原發性打擊會直接損傷神經細胞,剪切軸突,在初期造成脊髓組織的毀滅性損失。同時,內皮細胞間緊密連接的結構被破壞,血管和血脊髓屏障發生損傷,從而引起一系列繼發性損傷,如細胞毒性反應、神經遞質積累、自由基產生、細胞死亡、脫髓鞘、軸突變性和死亡。然而,盡管許多患者在SCI后表現為臨床完全性脊髓損傷,但有部分患者在神經病理學上表現為不完全性損傷,這給了我們希望,通過適當的治療來減少繼發性損傷,可能會減少脊髓損傷的功能影響。在繼發性損傷階段,微環境會發生顯著變化。繼發性損傷期可進一步分為急性期、亞急性期和慢性期,這三個階段所涉及的微環境各不相同[8-9]。

在撞擊后不久(10 ～ 15 min)的急性期,毛細血管豐富的中央灰質出血,白質水腫[10],如果不對出血進行干預,完全缺血周圍的細胞將直接發生壞死,可進行性形成囊性空泡,并對造成不可逆的損害[11]。隨后,各種細胞因子和趨化因子將迅速滲入破裂的BSCB,導致嚴重的炎性應激反應[12-13];在亞急性期,神經元、軸突和少突細胞大量損失,小膠質細胞、巨噬細胞和其他炎性細胞被激活,從而損傷部位發生嚴重的炎性反應,星形膠質細胞大量增殖且變得活躍,促進損傷部位角質瘢痕的形成;在慢性期,星形膠質細胞等細胞使疤痕進一步增厚,與亞急性期相比,可以在一定程度上限制炎癥,但這也可以作為神經突生長和再生細胞遷移的物理和生化屏障。一些少突膠質細胞前體細胞(OPCs)分化為產生髓磷脂的新少突膠質細胞。

2 基于微環境調控的SCI修復策略

2.1 調節SCI微環境防止出血和局部缺血 脊髓損傷后,脊髓血管支持立即喪失,導致損傷中心周圍局部缺氧,隨后發生一系列分子級聯反應,導致微血管通透性增加和BSCB破壞。新生血管的形成過程,在傷口愈合的增殖階段起著重要作用,穩定臨時血管和形成永久性血管網絡是脊髓損傷后組織修復的必要條件。通過調節微環境以防止SCI后失血量過度和促進損傷部位血管生成來防止更多的繼發性損傷反應具有重要意義。由于神經干細胞能夠分化為具有功能的神經細胞,并向損傷的微環境中分泌有益的旁分泌因子,因此神經干細胞正逐漸成為脊髓損傷的再生治療方法。Lee等[14]成功地從癲癇患者的顳葉中分離和培養了成人多功能神經細胞(ahMNCs),并以嚙齒類動物SCI小鼠為模型,評估ahMNCs對SCI的治療效果和治療機制。小鼠挫傷7 d后,將1×106個ahMNCs移植到損傷脊髓中,由于ahMNCs旁分泌促進血管生成的活性,CD31陽性微血管數量顯著增加。表明ahMNCs通過替代受損神經細胞和促進脊髓損傷微環境血管生成的作用,在脊髓損傷中具有顯著的治療效果。

堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)在整個神經系統中表達,具有促進神經元的增殖和有絲分裂及新生血管重建,改善BSCB的滲透性,調節損傷修復所需的微環境的穩定性等功能[15]。然而,由于bFGF穩定性差、半衰期短、結構復雜、酶失活等限制了其良好的治療效果。而且,脊髓損傷復雜的病理生理結構往往限制了全身給藥,尤其是BSCB,它阻止了大分子藥物通過循環到達脊髓[16]。Wu等[17]將具有損傷病灶靶向能力的CAQK肽(Cp)和具有穿透bscb能力的R2KC肽(Rp)移植到脂質體(Lip)上制備一柔性、無創給藥系統(bFGF@Lip-Cp&Rp)。該系統既可以促進脂質體穿過BSCB,又可以促進脂質體在脊髓損傷處的靶向和聚集。結果采用western blot和免疫熒光檢測血管內皮生長因子A (VEGF-A)和新生血管因子血小板內皮細胞粘附分子-1 (CD31)的數量,發現bFGF@Lip-Cp處理組刺激后VEGF-A和CD31的表達量高于其他各組,證明bFGF@Lip-Cp&Rp不但可以促進脊髓損傷部位血管生成和緊密連接蛋白的表達,還增強了由微血管內皮細胞組成的新血管的完整性。為不久的將來脊髓損傷的治療和管理提供了新的選擇。

2.2 調節SCI微環境改變細胞分化 脊髓損傷的發病機制涉及多種細胞,因此通過調節微環境來改變細胞命運,使其更有利于細胞的再生具有重要意義。最常用的策略是：減少阻止再生的細胞;增加促進恢復的細胞;或者移植我們需要的特定細胞或預分化的干細胞[19]。

由于不利的微環境,NSCs不能分化為神經元[20]。因此,激發內源性干細胞的有利分化對于脊髓損傷修復具有重要意義。Li等[21]構建了一種西妥昔單抗修飾的線性有序膠原蛋白支架,將其植入到犬脊髓損傷部位后,能夠顯著減少病變部位的硫酸軟骨素蛋白多糖(CSPGs)沉積,減少瘢痕的形成,還可以激活內源性神經發生,實現神經元再生,包括神經元分化、成熟、髓鞘形成和突觸形成。最終實現顯著的運動恢復。

此外,干細胞移植能夠替代脊髓損傷缺失的神經細胞,分泌促再生因子保護受損組織細胞和神經[22-23]。目前,神經干細胞(NSCs)在脊髓損傷動物模型治療中的應用主要集中在脊髓擠壓損傷模型。將NSCs移植到受損脊髓組織中,可有效促進機體功能的恢復。Lu等[24]將表達GFP的NSCs嵌入含有生長因子混合物的纖維蛋白基質中,并移植到嚴重脊髓損傷部位。被移植細胞可以分化成包括神經元在內的多種細胞表型,軸突傳導略有改善。移植的NSCs分化形成的神經元支持電生理繼電器的形成,在完全脊柱橫斷的部位,恢復脊髓部分功能。骨髓間充質干細胞(MSCs)移植也是治療脊髓損傷應用很廣泛的治療方法。臨床試驗中用于治療脊髓損傷的主要干細胞類型是骨髓間充質干細胞(BMMSC),其免疫原性較低,來源廣泛,易于分離、倫理問題少、腫瘤發生風險低[25]。 Okuda等[26]采用抗壞血酸法制備雌性大鼠骨髓間充質干細胞片,將其移植到T-8水平2 mm大小的脊髓缺損中。移植后2周和8周,分別采用抗tuj1抗體和膠質纖維酸性蛋白(GFAP)抗體進行免疫組化分析,評估軸突再生和膠質瘢痕形成情況。結果表明骨髓間充質干細胞片在移植后2周促進了軸突再生,移植后8周,tuj1陽性軸突在薄片上明顯延長。并且小鼠在移植后2周和8周后肢運動功能得到改善,這進一步證明了BNNSC在脊髓損傷治療中的有效性。

2.3 調節SCI微環境減少炎癥和強化的免疫反應 創傷性脊髓損傷發生后,脊髓組織立即重建,數周達到高峰,并會一直持續[27]。在重建過程中,損傷部位出現嚴重的神經炎癥,導致免疫系統、血管系統和神經系統一系列變化。這些微環境的變化將反過來損害遷移的干細胞,并擴大神經凋亡,粉碎神經再生的潛力[28]。

SCI后,炎癥會誘導神經元死亡,這種繼發性損傷的關鍵介質是白細胞介素(IL)-1。IL-1會進一步誘導的其他炎性介質釋放,如腫瘤壞死因子(TNF)-α和環氧合酶-2,從而加劇神經元損傷。Zhang等[29]使用慢病毒將增強綠色熒光蛋白(eGFP)和HSV1-39tk轉導到嗅球細胞(OECs),并通過熒光成像和[18]FHBG研究進行監測。OECs移植到SCI動物模型中,到達病變部位的OECs可通過病變部位激活的小膠質細胞釋放促炎細胞因子激活,表現為脊髓組織中白細胞介素-1受體拮抗劑(IL-1Ra)表達上調,促炎趨化因子IL-1α、IL-1β表達下調,大大地緩解了損傷部位的神經炎癥,對脊髓損傷有很高的治療效果。

小膠質細胞是中樞神經系統中的免疫細胞,可評估中樞神經系統是否受損或感染,吞噬死細胞和細胞碎片,并參與神經發育過程中的突觸重塑。脊髓損傷后小膠質細胞被激活,釋放促炎因子并引起繼發性損傷,但同時它們也可以發揮有益作用,包括抑制病變擴張、清除碎片和產生抗炎因子。誘導型一氧化氮合酶(iNOS)是M1表型小膠質細胞的標志物,在脊髓損傷后過度表達,并加劇炎癥和神經元變性的進展。CD163 (cluster of differentiation-163)作為M2表型小膠質細胞的標志物,在神經損傷后發揮保護作用[30]。目前,來自間充質干細胞的外泌體已被證明在脊髓損傷治療中具有巨大的潛力。Han 等[31]使用甲基丙烯酰(GelMA)水凝膠雜交3D培養的MSCs來源外泌體(GelMA-MN@3D-Exo)構建了用于SCI治療的微針陣列貼片,可通過促進SCI后微環境中小膠質細胞由M1表型向M2表型轉化,有效降低神經炎性反應。免疫熒光結果顯示,與SCI組比較,3D-Exo組iNOS+小膠質細胞數量明顯減少,CD163+小膠質細胞數量明顯增加。這些結果進一步解釋了GelMA-MN@3D-Exo移植通過有效和持續地傳遞整合的MSC-Exos在治療大鼠SCI中發揮良好治療效果的潛在機制。

脊髓損傷后的炎性反應也受巨噬細胞激活的動態平衡調節。被IFN-γ激活的巨噬細胞具有神經毒性作用,而被IL-4激活的巨噬細胞,作為M (IL-4)的手段,可以抑制有害的免疫反應并促進損傷修復[32]。在一篇報道中,Zhang等[33]將嗅鞘細胞OECs和雪旺細胞(SCs)共移植到SCI大鼠體內,探索其對損傷大鼠脊髓巨噬細胞前或抗炎因子表達和極化的影響。共移植組中,移植的細胞分布更廣泛,損傷部位星形膠質細胞數量、小膠質細胞/巨噬細胞浸潤、趨化因子(CCL2和CCL3)表達明顯減少,IL-10、IL-13表達水平升高,IL-6、TNF-α表達水平降低,囊腔面積縮小,運動功能改善。且OEC和SC共移植可促進巨噬細胞表型由M(IFN-γ)向M(IL-4)轉移,最終損傷部位炎癥細胞浸潤減少,炎性因子和趨化因子得到調控,為脊髓損傷修復提供更好的免疫環境。

2.4 調節SCI微環境減少瘢痕的形成 脊髓損傷后形成的瘢痕可分為神經膠質瘢痕和纖維性瘢痕。研究表明,神經膠質瘢痕形成是脊髓損傷病理的重要組成部分,在脊髓損傷急性期具有積極的神經保護作用[34]。其中星形膠質細胞在神經膠質瘢痕的形成中發揮重要作用,星形膠質細胞作為中樞神經系統的有機組成部分,對正常的神經元發育、突觸形成、神經回路功能和動作電位的傳播具有重要作用。但在神經炎癥和缺血誘導下反應性星形膠質細胞會分化為A1和A2表型。A1星形膠質細胞上調補體級聯基因的表達,這些基因會破壞突觸,對神經系統有害。相反,A2星形膠質細胞上調各種神經營養因子的表達,可能對神經有保護作用。這些星形膠質細胞最終形成疤痕的星形膠質細胞,通過反應性星形膠質增生的過程阻止軸突再生和神經修復。在瘢痕形成階段,Ⅰ型膠原在脊髓中高水平表達,通過整合素-n-鈣粘蛋白途徑誘導星形細胞瘢痕形成,阻止軸突再生[35]。損傷后2 d至2周,損傷部位的星形膠質細胞大量增殖,其大胞體與突起緊密連接,形成膠質瘢痕;此時,神經組織從炎性細胞中被分離出來,減輕了SCI早期的神經炎性反應。損傷后2周到6個月,星形細胞瘢痕逐漸成熟。由于膠質瘢痕和其他抑制因子(如CSPGs和髓鞘相關蛋白)的存在,軸突再生受到限制。損傷后6個月,瘢痕得到不斷強化,逐漸形成囊腫和空洞。此時,疤痕成為一種堅硬的物理和分子屏障,限制了炎癥擴散,然而,這也阻礙了軸突的再生和生長[36-37]。

而纖維瘢痕是由損傷部位硬腦膜和血管周圍成纖維細胞活化,侵入損傷部位的增生性肥大而形成的。纖維疤痕形成機械屏障,抑制軸突再生和功能恢復,導致永久性功能缺陷[38]。成纖維細胞可減少神經元的長度,分泌細胞外基質成分(如纖維連接蛋白、Ⅳ型膠原和層粘連蛋白)并增殖肥大,形成阻礙軸突生長恢復的機械屏障。成纖維細胞還能分泌軸突生長抑制分子(CSPGs、NG2蛋白聚糖、肌腱蛋白C等),嚴重阻礙軸突再生和功能恢復[39]。因此,減少瘢痕的形成是修復SCI必須克服的問題。

Fan等[40]提出將3D甲基丙烯酸明膠(GelMA)水凝膠與iPSC來源的NSCs (iNSC)相結合制備了GelMA/iNSC水凝膠復合體,以促進脊髓損傷后的再生。體外實驗證實iNSC能夠在3D GelMA水凝膠中存活且具有良好的分化能力。以小鼠脊髓橫斷模型為疾病模型,評估了GelMA水凝膠在體內的神經再生效果,結果表明GelMA/iNSC植入物能夠顯著促進小鼠功能恢復,且組織學分析顯示,GelMA/iNSC處理組的小鼠SCI部位的空洞面積和膠原沉積明顯減少, 且GelMA和iNSC聯合移植通過減少活化的巨噬細胞/小膠質細胞(CD68陽性細胞)明顯減輕損傷部位炎癥。顯著抑制了GFAP陽性細胞和膠質瘢痕形成,同時促進了軸突再生,大大改善了SCI修復效果。

Wang等[41]開發了一種基于聚唾液酸(PSA)的二甲胺四環素負載納米藥物傳遞系統(PSM),用于脊髓損傷的協同治療。制得的PSM具有明顯的體外和體內抗炎和神經保護作用。PSM能保護神經元和髓鞘免受損傷,減少膠質瘢痕的形成,向損傷部位招募內源性神經干細胞,促進神經元再生和膠質瘢痕長軸突的延伸。從而大大改善了脊髓損傷大鼠的運動功能,發揮了較好的治療效果。

轉化生長因子β(TGFβ)是激活靜息成纖維細胞的主要催化劑之一。TGFβ信號通路可激活脊髓損傷區硬腦膜及血管附近的成纖維細胞,使成纖維細胞增殖、遷移、分泌細胞外基質,促進組織纖維化過程。Jin等[42]通過對脊髓損傷小鼠連續28 d每天腹腔注射不同濃度的芹菜素,并采用Basso小鼠評分(BMS)評分、蘇木精-伊紅染色和免疫組織化學染色評價芹菜素對瘢痕形成和運動功能恢復的影響并檢測脊髓組織勻漿中纖維化相關參數的表達。采用NIH-3t3細胞和小鼠原代脊髓成纖維細胞、α-平滑肌肌動蛋白(α- SMA)、膠原蛋白1和纖維連接蛋白評價芹菜素的體外作用,以及對TGFβ/SMADs信號通路的影響。結果表明：芹菜素抑制小鼠脊髓纖維瘢痕形成,促進運動功能恢復。在體外通過抑制TGFβ-誘導的SMAD2/3磷酸化和核易位,在體內降低成纖維細胞相關參數的表達,增加神經生長因子的含量,降低肌成纖維細胞的活化和膠原纖維的形成,抑制脊髓損傷后纖維瘢痕的形成,并促進了小鼠功能的改善。

3 討論

SCI是一種嚴重的生理和心理負擔,目前尚無治愈方法。SCI的微環境錯綜復雜,微環境失衡是SCI再生和恢復差的主要原因。目前,人們已經開發出針對SCI微環境一系列的調控方法,且針對SCI微環境的治療也表現出巨大的優勢和潛力,尤其對于SCI的修復,提供了新的治療理念。然而針對SCI微環境修復損傷脊髓的研究處于新興階段,仍然存在諸多技術困難,亟待進一步解決。其中,在分子、細胞、組織三種不同水平,影響SCI修復的因素眾多,設計一種同時兼顧各因素的治療手段也是一大難題。因此,進一步研究并闡明SCI微環境調控機制對SCI患者的神經功能修復具有重要意義。