烏奴龍膽組培快繁體系研究

魯躍東 尼珍 央金拉姆

西藏自治區高原生物研究所，拉薩 850000

烏奴龍膽Gentiana urnulaH.Smith 屬龍膽科龍膽屬多年生草本植物，二級瀕危藏藥植物[1]，藏文名為“崗嘎瓊”。其藥用歷史悠久，始載于《四部醫典》《晶珠本草》，后被《部藏標》《藏標》《中國藏藥》收錄，是現行部頒標準藏藥制劑“二十五味大湯丸”等的主要成分，是著名藏藥“佐太”“二十五味松石丸”等制劑中松石炮制過程必備的解毒藏藥之一[2]。其味苦，全草用于血和赤巴并發癥，木布病、血管閉塞病、中毒性發熱、熱性腹瀉、流行性感冒發燒、咽喉腫痛、黃疸病[3]。

烏奴龍膽主產于中國西藏和青海西南部，生于高山礫石帶、高山草甸和沙石山坡、海拔3900～5700m等地[4]，在尼泊爾、錫金、不丹也有分布，以我國西藏所產的質量較優。高4～6cm，具發達的匍匐莖，須根多數，略肉質、淡黃色、枝多數、稀疏叢生、直立、極低矮、節間短縮，花果期8—10月。

據調查，烏奴龍膽野生資源趨于瀕危狀態，遠不能滿足藏藥生產對烏奴龍膽的需求，因此建立烏奴龍膽的快繁體系十分必要。關于烏奴龍膽的研究報道很少，主要集中于研究其化學成分[4-8]，在組培擴繁方面未見報道，本研究選用采自西藏自治區拉薩市堆龍德慶區羊達鄉境內的烏奴龍膽植株進行組培快繁實驗，重點探討不同外植體不同HgCl2溶液消毒時間的消毒效果、不同不定芽誘導分化培養基的誘導效果以及不同生根培養基的生根效果，旨在總結出一套適合烏奴龍膽的組培方法，建立其組培快繁體系，以達到充實市場需求和減緩野生資源保護壓力的目的。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試烏奴龍膽植株于2018 年6 月采集于西藏自治區拉薩市堆龍德慶區羊達鄉境內。組培實驗在西藏自治區高原生物研究所植物組培研究室的實驗室進行。

圖1 烏奴龍膽植株Figure 1 Gentiana urnula plants

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基配置

1.2.1.1 初始培養基。初始培養基用于外植體消毒實驗，配方為：MS+0.1g/L 肌醇+30g/L 蔗糖+5g/L 瓊脂粉（pH5.6）。

1.2.1.2 不定芽誘導分化培養基。不定芽誘導分化培養基選用MS作為基礎培養基，附加0.1g/L肌醇、30g/L蔗糖和5g/L 瓊脂粉，再添加不同濃度的6-BA 和IAA，共設7個處理組和1個對照組，配方設計見表1。

表1 不定芽誘導分化培養基配方Table 1 Formula of adventitious bud inducting and differentiating culture medium

1.2.1.3 生根培養基。生根培養基選用1/2MS培養基作為基礎培養基，附加0.1g/L 肌醇、30g/L 蔗糖和5g/L瓊脂粉，再添加不同濃度的NAA和IBA，共設7個處理組和1個對照組，配方設計見表2。

表2 生根培養基配方Table 2 Rooting culture medium formula

1.2.2 培養條件。培養條件分白天、夜晚兩個時段，白天溫度22±2℃，光照強度1000～1500Lx；夜晚溫度8±2℃，無光照。外植體消毒實驗培養30d，不定芽誘導分化實驗培養30d，生根培養實驗培養60d。

1.2.3 外植體和消毒時間篩選。切取健壯且無病蟲害的烏奴龍膽植株帶節莖段（0.5～1cm）和葉片塊（0.5～1cm2）作為外植體，用自來水把外植體表面污漬沖洗干凈。然后用肥皂水清洗外植體3～5min，再用自來水反復將肥皂水殘液沖洗干凈，置于超凈工作臺上。接著用75%酒精清洗外植體15s，再用無菌水振蕩清洗3 次，每次不低于1min。最后將外植體放入HgCl2溶液中分別消毒2、4、6、8、10min，再用無菌水振蕩清洗3次，每次不低于1min。

將消毒好的外植體，用無菌濾紙吸干表面水分，去除接觸HgCl2溶液的傷口部分，接入初始培養基。兩種外植體每個處理接種10瓶，每瓶1個外植體，3次重復。培養30d后統計并計算未污染率和成活率。

1.2.4 不定芽誘導分化培養基篩選。選用成功消毒后的外植體作為實驗材料，接入8種“不定芽誘導分化培養基”，每個處理接種10瓶，每瓶1個外植體，3次重復。培養30d 后統計并計算愈傷組織出愈情況、芽的增殖倍數、芽的平均長度、未白化率和未玻璃化率。

1.2.5 生根培養基篩選。經過誘導分化形成的叢生芽，待其發育成2～3cm 叢生苗，具有2～3 片葉時，轉接入8種“生根培養基”，每個處理接種10瓶，每瓶1株苗，3 次重復。培養60d 后統計并計算平均生根數、平均根長度、平均根健康率和平均生根率。

2 結果與分析

2.1 數據處理

實驗結果數據使用Excel 2016軟件進行初步處理；SPSS 26進行單因素方差分析，多重比較采用LSD法。

結合3 次重復實驗各指標的平均值，采用模糊隸屬函數法對不同消毒時間、不同不定芽誘導分化培養基、不同生根培養基的效果進行綜合評價，先計算出某一指標的隸屬函數值，然后再計算出每個處理的平均隸屬函數值，其計算方程為[9]：

式中：Uij為i處理j指標的隸屬函數值，Xij為i處理j指標的值，Xjmax為所有處理中此指標的最大值，Xjmin為所有處理中此指標的最小值，Ui為i 處理各指標的平均隸屬函數值，n為指標數。

2.2 不同烏奴龍膽外植體及不同消毒時間的消毒效果

計算3次重復實驗各處理組外植體的平均未污染率和平均成活率。

平均未污染率=（未出現污染現象的瓶數/接種瓶數×100%）/3

平均成活率=（成活數/接種數×100%）/3

由表3 可知，平均未污染率與HgCl2溶液消毒時間呈正相關；帶節莖段作為外植體的平均成活率與HgCl2溶液消毒時間呈負相關；葉片塊作為外植體，所有處理的平均成活率都為0.00%.由此可見，消毒時間越長，污染數越少，但毒害也越大；烏奴龍膽葉片塊不適合用作外植體消毒實驗的材料。單因素方差分析和多重比較表明，帶節莖段不同處理組間的平均未污染率（P=0.000＜0.05）和平均成活率（P=0.000＜0.05）呈現顯著差異；葉片塊不同處理組間的平均未污染率（P=0.000＜0.05）呈現顯著差異。

基于HgCl2溶液不同消毒時間帶節莖段的平均未污染率和平均成活率，計算平均隸屬函數值，對不同消毒時間的消毒效果進行綜合評價，見表4?？芍猆6min＞U8min＞U4min＞U10min=U2min，結果表明，綜合各因素，帶節莖段作為外植體的最佳消毒時間為6min。

表4 不同消毒時間帶節莖段消毒結果指標隸屬函數值Table 4 Subordinate function values of disinfection results for stem segments with different disinfection times

2.3 不同誘導分化培養基對不定芽誘導增殖的影響

選用成功消毒后的帶節莖段作為實驗材料，進行不定芽誘導增殖實驗。計算3次重復實驗各處理組的平均芽增殖倍數、平均芽長度、平均未白化率和平均未玻璃化率。

平均芽增殖倍數=（總分化芽數/接種數）/3

平均芽長度=（所有芽長度之和/總分化芽數）/3

平均未白化率=（未出現白化現象的瓶數/接種瓶數）/3

平均未玻璃化率=（未出現玻璃苗現象的瓶數/接種瓶數）/3

根據表5 實驗結果數據，由“平均芽增殖倍數”數據可知，由于P1、P2、P5、P6、P7 處理組添加了6-BA，P3、P4處理組未添加6-BA，導致前者的平均芽增殖倍數明顯大于后者，可見6-BA 對芽有明顯的增殖效果；而P2、P7 處理組添加的6-BA 濃度大于P1、P5、P6 處理組，導致前者的平均芽增殖倍數大于后者，可見2.0mg/L 6-BA 的效果要強于1.0mg/L 6-BA。由“平均芽長度”數據可知，由于P3、P4、P5、P6、P7處理組添加了IAA，P1、P2 處理組未添加IAA，導致前者的平均芽長度明顯大于后者，可見IAA 對芽的增長有明顯的效果；而在其他條件相同的情況下，P4 處理組（2.0mg/L IAA）平均芽長度大于P3 處理組，P6 處理組（2.0mg/L IAA）平均芽長度大于P5 處理組，可見2.0mg/L IAA 的效果要強于1.0mg/L IAA。隨著添加的激素總濃度的提高，出現白化現象和玻璃苗的情況有不同程度的增多。單因素方差分析和多重比較表明，不同處理組間的平均芽增殖倍數（P=0.000＜0.05）、平均芽長度（P=0.000＜0.05）和平均未玻璃化率（P=0.028＜0.05）呈現顯著差異，平均未白化率（P=0.057＜0.05）差異不顯著。

表5 不同誘導分化培養基對不定芽誘導增殖的影響Table 5 Effects of different inducing and differentiating media on the induction and proliferation of adventitious buds

實驗過程中，各處理組均未發現愈傷組織的形成。

基于各處理組的平均芽增殖倍數、平均芽長度和平均未玻璃化率，計算平均隸屬函數值，對不同不定芽誘導分化培養基的效果進行綜合評價，見表6。由于各處理組間的平均未白化率差異不顯著，所以該指標不加入計算分析。結果表明，UP7＞UP6＞UP5＞UP1＞UP2＞UP3＞UP0＞UP4，綜合各因素，P7 處理組（MS+0.1g/L肌醇+30g/L蔗糖+5g/L瓊脂粉+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L IAA）為最佳不定芽誘導分化培養基。

表6 不同不定芽誘導分化培養基處理結果指標隸屬函數值Table 6 Subordinate function values of different inducing and differentiating media treatment results for adventitious buds

2.4 不同生根培養基對烏奴龍膽生根的影響

計算3 次重復實驗各處理組的平均生根數、平均根長度、平均根健康率和平均生根率。

平均生根數=（總生根數/接種瓶數）/3

平均根長度=（所有根長度之和/總生根數）/3

平均根健康率=（健康顏色根數/總生根數）/3

平均生根率=（生根瓶數/接種瓶數）/3

由表7 可知，除CK 外，其他各處理組的平均生根率均為100%；NAA 和IBA 都對烏奴龍膽生根有明顯的促進作用，且NAA 效果更佳；0.5mg/L NAA 促進生根作用要強于0.3mg/L NAA；IBA 對根的增長有明顯促進作用，且0.5mg/L IBA 效果要強于0.3mg/L IBA；隨著添加的激素總濃度的提高，根的顏色出現不健康的情況有不同程度的增多。單因素方差分析和多重比較表明，不同處理組間的平均生根數（P=0.000＜0.05）、平均根長度（P=0.000＜0.05）和平均根健康率（P=0.000＜0.05）呈現顯著差異。

表7 不同生根培養基對烏奴龍膽生根的影響Table 7 Effects of different rooting culture media on the rooting of Gentiana urnula

基于各處理組的平均生根數、平均根長度和平均根健康率，計算平均隸屬函數值，對不同生根培養基的生根效果進行綜合評價，見表8?？芍猆T5＞UT6=UT2＞UT7＞UT4＞UT3＞UT1＞UT0，綜合各因素，T5 處理組（1/2MS+0.1g/L 肌醇+30g/L 蔗糖+5g/L 瓊脂粉+0.3mg/L NAA+0.3mg/L IBA）為最佳生根培養基。

表8 不同生根培養基處理結果指標隸屬函數值Table 8 Subordinate function values of different rooting culture media treatment results

圖2 烏奴龍膽組培過程Figure 2 Tissue culture process of Gentiana urnula

3 討論

綜上所述，為了建立烏奴龍膽的組培快繁體系，本研究選用采自西藏自治區拉薩市堆龍德慶區羊達鄉境內的烏奴龍膽植株進行組培快繁實驗。

本研究切取烏奴龍膽的帶節莖段和葉片塊作為外植體，采用HgCl2溶液設計出不同時間梯度，進行消毒實驗；之后設計出7 種不定芽誘導分化培養基和7種生根培養基對烏奴龍膽進行誘導生芽和生根實驗。實驗結果表明，帶節莖段適合作為烏奴龍膽組培實驗中的外植體，葉片塊不適合作為外植體；HgCl2溶液最佳消毒時間為6min；最佳不定芽誘導分化培養基為：P7 處理組（MS+0.1g/L 肌醇+30g/L 蔗糖+5g/L 瓊脂粉+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L IAA）；最佳生根培養基為：T5處理組（1/2MS+0.1g/L 肌醇+30g/L 蔗糖+5g/L 瓊脂粉+0.3mg/L NAA+0.3mg/L IBA）。

烏奴龍膽的生根能力較強，在所有的生根培養基中生根率均達到了100%，且在實驗過程中還發現在生根培養基（CK）和不定芽誘導分化培養基中亦有部分叢生苗生長出根，但是在添加不同濃度的NAA和IBA后，烏奴龍膽的生根數量和根長度有顯著差異，其中NAA能明顯促進烏奴龍膽生根，IBA能明顯促進烏奴龍膽根的增長。與此同時，隨著添加的激素總濃度升高，烏奴龍膽根的顏色出現不健康的情況也有不同程度的增多，在不定芽誘導增殖實驗中同樣有類似現象產生。

根據植物細胞的全能性，理論上任何完整的植物細胞都有形成新的完整植株的潛力［10］，但是在實踐中發現，不同器官的發育能力各不相同。在龍膽屬植物的組織培養中，鐘世浚利用紅花龍膽帶節莖段成功得到叢生苗［11］，邢震利用藍玉簪龍膽莖段成功得到叢生苗［12］。本研究中，烏奴龍膽葉片塊進行消毒處理后全部褐化死亡，不適合作為烏奴龍膽組培外植體，這與鐘世浚、邢震的實驗結果相似。查閱更多文獻后發現，目前對龍膽屬植物的組培研究中，很少出現采用葉片外植體獲得叢生苗的，這也許與龍膽屬植物葉片中含有較多黃酮類物質而容易氧化導致褐化有關［13］。

植物組織培養是離體的組織，器官，經細胞脫分化形成愈傷組織，再分化形成芽、根，最終發育為完整植株的過程。本研究在進行不定芽誘導增殖實驗過程中，各處理組均未發現愈傷組織的形成，但直接長出了不定芽。分析原因可能如下：（1）培養基激素濃度配比或培養條件不適合烏奴龍膽帶節莖段愈傷組織的形成；（2）烏奴龍膽帶節莖段不太容易形成愈傷組織［14］，但是可以從節上長出腋芽（不定芽），從而跳過了形成愈傷組織這一過程。