靶向肌肉神經重建可預防和逆轉神經離斷后大鼠的疼痛行為

一、研究背景

靶向肌肉神經重建(targeted muscle reinnervation, TMR)是截肢手術的一種神經處置方法。其初始目的是控制生物電假體，但對截肢后疼痛和神經瘤有作用。一項多中心隊列研究表明，在截肢后2周內接受TMR 的病人中，49.2%完全無殘肢痛，45.3%無幻肢痛。而普通截肢（無TMR）病人中，無殘肢痛和幻肢痛的比例分別為19.5%和21.5%。此外，TMR 病人服用的阿片類藥物數量顯著較少，另外兩項研究也證明了類似的早期TMR 在緩解疼痛方面的療效。目前TMR 也越來越多地用于治療神經病理性疼痛。

在TMR 中，神經遠端被切除，近端與小的運動分支吻合。例如，在肱骨截肢術中，正中神經被包裹在肱骨的運動分支上?？紤]到神經修復和再生，預計TMR 手術可能導致神經瘤形成和相關疼痛增加。TMR有意地將神經與不匹配的大尺寸進行匹配，而忽略了模態匹配，即大型混合運動感覺神經與微小的肌內運動分支相連。與神經瘤切除(neuroma excision, NE)或NE 移位術相比，假設TMR 是有效果的，因為它使神經“有地方可去，有事可做”。然而，臨床研究提供的機會有限，無法探討TMR后截肢病人疼痛減輕的機制。并且在臨床應用中，在截肢后6～12 周進行的TMR 療效可能不如截肢時進行TMR。因此，需要了解TMR 相關疼痛緩解的機制，以提高其緩解神經損傷后疼痛的功效。

既往的TMR 動物模型評估了截肢時神經軸突組織形態計量學和皮質的記錄。但沒有測量疼痛，因為大多數經過驗證的動物疼痛行為測量都需要存在受影響的肢體。在該研究中使用大鼠脛神經和腓總神經切斷的保留性神經損傷(spared nerve injury,SNI)模型不僅模擬截肢，而且模擬主要神經切除和由此產生的神經性疼痛的一般情況。此外，評估了TMR 手術時機對損傷的影響，這對臨床應用具有關鍵意義。

二、研究方法

1.動物分組

成年雄性SD 大鼠被隨機分配到不同的干預組。干預手術（即TMR、NE 或假手術）的時機因評估不同假設而有所不同。Sham 組：SNI 后3 周后進行假TMR 手術；神經瘤切除術-3 (NE-3)：SNI 術后3 周后NE；靶向肌肉神經重建-3 (TMR-3)：SNI 術后3 周后TMR；神經瘤切除術-12 (NE-12)：SNI 術后12 周后NE；靶向肌肉神經重建-12 (TMR-12)：SNI 術后12 周后TMR；即刻靶向肌肉神經重建(iTMR)：SNI 術后即刻TMR。

2.疼痛行為測量

將大鼠單獨置于1/4 英寸網格上的透明塑料圍欄 (13 cm×25 cm×25 cm) 中進行測試。所有大鼠在實驗室內適應1 h。所有的行為測試均由一個對干預組不知情的研究人員進行。所有刺激均應用于手術的左外側足底和未手術的右外側足底。主要監測的疼痛行為學指標包括vonFrey 測試、針測試、動態刷測試、Hargreaves 測試、丙酮測試。在SNI后1 周和干預前即刻進行疼痛行為學評分。若大鼠的疼痛行為與基線水平相比無明顯變化，則排除其進一步干預。

3.神經刺激

NE-3 組大鼠在NE 術后3～7 周觀察是否發生神經再支配。暴露原結扎部位近端腓總神經和脛神經，對神經分支進行刺激。采用神經刺激器(checkpoint surgical, cleveland, OH)分別刺激每條神經，產生振幅為0.05 mA、持續時間為100 μs 的單個脈沖。以刺激腓腸神經作為陰性對照。記錄肌顫的出現作為對刺激的反應。

三、研究結果

1.TMR 可減輕已建立的創傷性神經病理性疼痛

SNI 后3 周，大鼠被隨機分配接受TMR、假手術或NE，并在這些干預后1、3、6 和12 周進行行為學比較。假手術組為暴露損傷坐骨神經和切斷運動支的對照組。NE 組可以鑒別神經瘤切除和運動支切斷的效果，與TMR 組比較，可以揭示TMR 對神經吻合的具體效果。在SNI 后，3 組的機械痛覺過敏（針）、點狀機械過敏 (vonFrey)、動態機械過敏（動態刷）和冷過敏（丙酮）迅速發展到相當的水平。在TMR-3 組中，痛覺過敏在干預后1 周迅速恢復至基線水平。同樣，vonFrey 閾值增加至基線水平，并在1、3、6 和12 周時顯著高于假手術組。動態機械過敏（動態刷）反應在1 周時也迅速下降，與假手術組和NE 相比保持降低，直到6周后效果消退。TMR 組1 周后冷刺激反應也下降了36%，且在干預后6 周仍較假手術組改善。相比之下，與假手術相比，NE 手術在干預后3 周和6 周僅在痛覺過敏方面減輕了疼痛行為。其他行為測量不受NE 的影響。SNI 不會產生任何熱過敏。這些發現表明，在SNI 后3 周進行的TMR 快速逆轉了疼痛表型。與假手術組相比，NE 組的痛覺過敏有所改善，但在第3 周和第6 周時，痛覺過敏較基線時升高，在機械超敏和痛覺超敏方面，第3 周和第6 周時的情況與假手術組和基線時相似。

使用Dunnett 檢驗進行二次分析，比較每個時間點的治療結果與前SNI 基線。結果表明，對于針和vonFrey 試驗，只有TMR-3 使干預后所有時間點的疼痛行為恢復至基線水平。冷刺激測試中，只有TMR-3 在第6 周和第12 周時恢復至基線水平。NE 組vonFrey 閾值在12 周時恢復至基線水平，動態刷測試在3 周和6 周時達到基線水平。對健側足部的分析顯示，疼痛行為與基線相比有微小變化。

2.術后神經再生與疼痛行為改變相關

為了評估NE 組隨時間推移疼痛行為改善的可能因素，在其他亞組大鼠中，采用直接神經刺激法，通過刺激切斷部位近端脛神經和腓總神經，確定其是否成功再生到遠端斷端。在NE 后3～4 周 (n= 3)，3 條脛神經和3 條腓總神經中各有2 條出現肌肉收縮，表明功能神經支配重建。對于所有大鼠，神經刺激表明至少一條神經是連續的。所有3 只大鼠的腓腸神經刺激均未引起任何肌肉收縮，證實神經被充分隔離以進行單獨刺激。另一組中，在干預后6～7周的較晚時間點 (n= 5)，刺激使5 條腓總神經中的2 條和5 條脛神經中的4 條產生了運動反應。觀察到對刺激無反應的神經近端位于傷口內，因此它們不指向切口遠端。這些發現以及再生纖維的組織學證據表明，早在NE 術后3 周，神經再生就足以與遠端建立連續性，前提是神經端彼此相對。NE 術后近端切口位置為未控制變量。并且NE-3 組的疼痛行為表現出隨時間推移而改善的趨勢，甚至在12周時的vonFrey 閾值以及3 周和6 周時的動態刷測試中恢復基線水平。

TMR-3 組于術后3～4 周進行神經刺激，7 例脛神經吻合中5 例出現股二頭肌神經再生，7 例腓總神經吻合中6 例出現半膜肌收縮。相比之下，在TMR-12 組中均沒有出現收縮。在干預后3～4 周，對TMR-3 和TMR-12 對合的免疫組織化學分析顯示，軸突跨越對合（β-tubulin III 染色），沒有大體神經瘤形成，并存在再生標志物Gap43。定性分析顯示，與TMR-12 組相比，TMR-3 組的β-tubulin III和Gap43 染色較多，這證實了神經刺激的結果，即TMR-12 組的神經再支配減少。

3.即刻TMR 可防止除冷超敏反應外的疼痛行為發展

接下來，進一步探討了TMR 在其他兩種臨床相關情況下是否有效：在神經病理性疼痛發生之前受傷時進行的TMR，以及TMR 應用于已確定的慢性神經病理性疼痛。為了回答這個問題，評估另外兩組大鼠：在SNI 時進行的TMR（即刻TMR，iTMR）和在SNI 后12 周進行的TMR (TMR-12)。將這些干預措施與SNI 后3 周進行的TMR (TMR-3)進行比較。iTMR 防止了痛覺過敏和機械超敏反應的發生。與基線相比，12 周時iTMR 組的動態機械超敏反應增加，但與TMR-3 無差異。在1 周和6 周時，iTMR 的冷超敏反應比基線增加，但與TMR-3 相比無顯著差異。TMR-12 組在所有評估中均未顯示疼痛行為減少，但動態機械超敏反應在6周時間點與基線和TMR-3 相似。這些數據表明，即刻和早期（損傷后3 周）干預均可預防或減輕疼痛行為。相比之下，受傷后12 周的干預效果微乎其微。此外，在iTMR 和TMR-12 組中，對側足部相對于基線的變化較小。進一步研究發現，SNI 后延遲 12 周的神經瘤切除對疼痛行為沒有影響。

最后，將NE-12 與TMR-12 進行比較，以確定神經瘤在12 周后持續疼痛行為中的任何相對作用。這表明不同干預措施之間無顯著差異。Dunnett 檢驗進行二次分析表明，在針、vonFrey 閾值和丙酮測試的所有時間點，兩種治療均未能逆轉SNI 誘導的疼痛行為。

四、討論

該研究測試了TMR 對嚙齒類動物主要神經損傷后頑固性疼痛表型的鎮痛效果。研究結果表明，在傷后即刻或傷后3 周進行TMR 可逆轉或顯著降低點狀機械過敏、痛覺過敏和冷過敏。這些疼痛行為的變化發生迅速，且影響至少持續12 周。然而，當TMR 延遲至SNI 術后12 周時，機械超敏反應和冷超敏反應仍較基線升高，反映了TMR 對慢性截肢病人的效果較差。這些發現有助于驗證該模型是一個合適的平臺，可用于對TMR 導致的傷害性通路變化進行機制探索。此外，該模型將有助于評估干預措施的改進，從而擴大其臨床適用性和療效。

以假手術和NE 作為TMR 的對照。首先，考慮到肌肉反應的變化，因為分離用于縫合的運動神經會影響對刺激的運動反應。第二，切斷結扎和神經瘤可以消除任何壓迫型損傷，因此TMR 組和NE組之間的唯一區別是切斷的近端神經是否直接吻合。與運動支的吻合提供了直接的運動神經再生靶點，并能立即接觸到對再生至關重要的神經營養因子。NE 組切斷的神經能再生，但未接觸到神經再生的靶點。然而，近端刺激顯示，NE 組的許多神經最終找到了遠端神經殘端，并成功地再支配了遠端肌肉。在NE-3 組中，神經再支配的時間與痛覺超敏和機械超敏的輕度改善相關。這些結果表明，在iTMR 和TMR-3 組中，神經瘤切除并不是觀察到的疼痛行為快速變化的重要組成部分。

相比之下，NE 組疼痛行為的后期減少突出了神經再支配與疼痛行為減少之間的聯系。神經再支配與再生的作用已在神經病理性疼痛模型中得到了很好的研究。SNI 后，再生過程在近端切斷神經中繼續，導致神經瘤紊亂和與疼痛行為相關的自發傳入纖維活動。如果SNI 后通過用Sema-3A 治療神經來阻斷再生和自發傳入，則機械超敏反應和異常性疼痛得到改善；而冷超敏反應仍不能恢復正常。同樣，在既有紊亂的神經瘤再生又有部分神經再支配的結扎模型中，阻斷再生也會減少疼痛行為。這些觀察結果表明，無神經支配的再生在一定程度上驅動了機械超敏反應和超敏痛覺類型的疼痛行為，而另一個過程可能維持冷超敏反應。

TMR 會產生較差的感覺再生環境，其次是顯著的大小不匹配和感覺運動不匹配。神經大小的不匹配會影響到運動和感覺纖維束逃逸，而混合的運動或感覺-運動神經吻合明顯有利于運動再生。對運動再生和神經再生的支持與TMR 的最初目的是一致的，即產生與假體通信的強運動信號。事實上，研究中的活體內神經刺激證實了運動神經再生的發生。在NE 組中，感覺-感覺匹配是可能的，這進一步支持了影響TMR 和NE 疼痛行為的不同機制。在TMR 中，有運動再生和神經再生，但感覺纖維和神經元發生了什么尚不清楚，這將是研究的關鍵組成部分。

在TMR-12 組中觀察到無變化的疼痛行為反映了在截肢后較久才進行TMR 的臨床觀察結果，且神經損傷在減輕或預防截肢相關疼痛方面效果較差，其機制可能與神經再生減少有關。Holmes 等的研究發現，將結扎12 個月的坐骨神經分支修復為健康神經時，僅再生35%的運動單位?？紤]到TMR 的大小不匹配，如果在12 周時進行干預，可能有一定比例的纖維必須實現神經再生，并且不再達到閾值。另一個關鍵因素是隨著時間的推移，疼痛逐漸集中，可能會降低任何外周干預的療效。在復雜性區域疼痛綜合征的大鼠模型中，早期外周給予傷害性受體拮抗劑時，對疼痛的改善有效，但在后期不再有效。隨著時間的推移，作為自發傳入活動的關鍵發生器的外周神經可能向背根神經節發生轉變。需要開展更多工作來確定療效喪失背后的機制。

更驚人的發現之一是TMR 后疼痛行為減輕的速度。TMR 后1 周內，大鼠疼痛行為恢復至SNI前基線水平。相比之下，NE 組未出現相同的快速反應。因此，建立對合有助于快速反應，而不僅僅是切除神經瘤。相比之下，慢性疾病完全缺乏這種快速反應，且隨著受傷時間的推移，自發活動和疼痛不再相關。在慢性壓迫性神經損傷后早期阻斷自發活動，可使其余神經損傷的自發活動降低至正常水平，并且在阻斷失去作用后仍能保持正常水平。然而，傷后10 天應用阻斷劑僅降低了阻斷期間的敏感性。這些發現進一步支持早期干預的關鍵性，并與12 周后應用TMR 時療效喪失相關。

自發傳入活動可由外周損傷和背根神經節神經元敏化引起。早期阻斷神經損傷部位的自發活動可防止神經元敏化。預防致敏可能是TMR 早期應用的另一個重要組成部分。一旦神經元過度興奮，TMR 對其外周軸突的作用可能對維持自發活動和相關疼痛無關。

該模型的局限性：在將其應用于截肢相關疼痛時，與截肢相關的變化（如皮膚變薄和殘端炎癥）也可能導致截肢病人的疼痛，但在模型中沒有出現；另外，神經必須結扎，這除了造成軸突切斷外，還會造成壓迫損傷。在手指截肢的情況下，燒灼和牽引神經切除術已經足夠，但通常的做法是在截肢前結扎較大的神經，因為它們的神經周圍血管系統會帶來血腫風險。

未來的工作需要研究TMR 在外周和中樞誘導的傷害性過程變化。使用SNI 和早期TMR 建立的模型顯示了對疼痛行為發展的預防。一個特別的挑戰是，在臨床和該模型中觀察到，延遲TMR不能逆轉疼痛行為，因此該模型可用于確定克服這一局限性的因素，以擴大可能從TMR 獲益的臨床人群。