人工海水條件下移動床生物膜反應器快速掛膜啟動試驗

楊吉平 郭黎明 王志 王朋

摘 要：海水循環水產養殖系統中，生物膜反應器的掛膜時間通常較長。為實現人工海水條件下移動床生物膜反應器（moving-bed biofilm reactor，MBBR）濾片的快速掛膜，通過攪拌濾片，采用低成本的海水配方、專用營養液以及選擇多樣化的菌種等方法和措施進行了試驗，并建立了以氨氮、亞硝酸鹽氮水平、濾片顏色和孔隙生成物為指標的評估體系。試驗結果表明，相比于化學營養組的56 d，發酵營養組經過46 d即完成了掛膜。掛膜過程中氨氮質量濃度最高為20.36～25.12 mg/L，亞硝酸鹽氮質量濃度最高為45.28～53.20 mg/L。

關鍵詞：循環水產養殖系統；移動床生物膜反應器；掛膜；人工海水

海洋食物生產發展趨勢的預測表明，基于海水養殖技術創新，未來幾十年內，人類從海洋中可持續收獲的蛋白質產量將大幅增加，海水養殖產量很快將反超捕撈產量，并不斷擴大其領先優勢［1］。循環水產養殖系統（RAS）被視為應對全球海產品需求增長的可持續解決方案之一［2］。

水產養殖過程中會產生很多含氮化合物，如氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮等，水體中這些含氮化合物的累積往往對養殖對象具有毒性影響，因此在RAS中如何分解這些含氮化合物尤為重要［3］。在商業化的RAS中，由于維護簡單和低能耗，移動床生物膜反應器（moving-bed biofilm reactor，MBBR）已成為去除含氮化合物的默認設計選擇［3］。MBBR依靠附著在懸浮載體中的硝化細菌等微生物來凈化水質，而微生物在載體表面的附著和固定的過程被稱之為“掛膜”［4］。成功“掛膜”意味著MBBR具備了持續處理含氮化合物的能力。

高鹽度會對微生物產生脅迫，硝化細菌對高鹽度非常敏感，加之硝化細菌在含鹽條件下生長速度緩慢，因此通常需要較長的時間才能成功掛膜［5-6］。在商業化的RAS中，應用MBBR時通常會出現以下問題：（1）生物膜形成周期長，導致運行成本增加。（2）掛膜期間RAS中累積的含氮污染物可能會對養殖動物造成不利影響。因此，亟須開發一種在RAS系統外的能夠使MBBR載體在海水條件下快速掛膜的方法。

影響MBBR載體掛膜的因素較多，主要分為載體因素和啟動因素。載體因素方面，載體的材質、形狀和孔隙對掛膜有直接影響。研究表明，具有表面脊的多孔生物膜載體（內部球形孔徑＞1 mm）是開發高效率MBBR載體的較好選擇［7］。由于塑料等材質表面的親水性較差，會降低MBBR載體的掛膜效率，因此，近年來關于MBBR載體改性的研究成為熱點，已有很多文章報道了親水改性的方法［8-15］，并獲得了較好的效果。啟動因素主要是指啟動過程中各種因素對載體掛膜的影響，其中啟動過程是指獲得特定濾片后進行的流化培養操作。在對海水硝化系統掛膜啟動速度的系統研究中，Li等［6］制定了入口氨氮濃度逐漸減少、入口鹽度逐步增加、添加顆粒有機物以及接種硝化細菌等不同策略，嘗試加快掛膜啟動的速度，結果顯示，入口鹽度逐步增加組在第63天完成硝化作用，比其他策略組快16～18 d。對影響掛膜的因素的研究還表明，氣水比［16］、營養物質［17-18］、C/N［19-21］、添加菌劑［22-24］、添加成熟的生物膜［25-26］以及增加鹽度［27-30］等均會影響掛膜啟動速度。但是，在掛膜應用過程中觀察到，很多養殖場在掛膜啟動前期，載體均被充入的空氣頂至濾池的頂部，無法充分接觸到水，因而影響了掛膜進度。在添加營養物質方面，現有的實驗室在掛膜過程中主要以氯化銨和碳酸氫鈉作為氮源和堿度來源［19-21，31-32］，或使用飼料粉末［17，33-34］、殼聚糖［18］、鐵離子［18］等增加營養，一些研究未綜合考慮與掛膜啟動相關的營養物質，另外在實際生產中可能更希望使用容易獲得的低成本原料來進行掛膜。在接種菌劑的選擇方面，一般污水處理掛膜的方法是直接投加活性淤泥，但活性污泥通常含有大量病原體，會帶來不可預見的風險，因此該方法不推薦應用在水產養殖系統中［35］。其他的掛膜試驗則是直接采用硝化細菌進行掛膜，一般是投加發酵工程生產的單一的硝化細菌種群，未考慮細菌生態中不同生態位群體的互補性，因而掛膜效果也不理想［6］。另外，水質監測和對膜片顏色及孔隙生成物的監測也非常重要，需要及時從數據中獲得信息，指導調節相關指標，如果對掛膜過程的監測不足，容易錯過改進掛膜效率的時間窗口。

本研究將通過攪拌濾片，采用低成本的海水配方、專用營養液和多樣化的菌種等方法和措施進行試驗，對各項影響MBBR載體掛膜的因素進行優化改進，以期在人工海水條件下實現載體的快速掛膜。

1 材料和方法

1.1 材料

待掛膜載體材料為試產的“濾片S”。詳見圖1?！盀V片S”是采用直徑30 mm的圓柱形塑料棒材，用刀頭切割成1 mm厚的“S”型彎曲片狀結構。使用顯微CT法測得的“濾片S”的比表面積約為1 600 m2/m3。在每口掛膜池中，濾片的堆積體積為400 L，填充率約為20%。

1.2 試驗分組及試驗步驟

為優化載體的浸沒狀態，進行攪拌試驗。其中攪拌組（S1組）在放入濾片和注入海水后，開啟機械攪拌裝置，而不開啟曝氣裝置；不攪拌組（S0組）則是不開啟機械攪拌裝置，開啟曝氣裝置。攪拌試驗連續進行7 d，觀察并記錄濾片的運動情況。

為對掛膜過程中投加的營養物質進行優化，設置發酵營養組（FN組）和化學營養組（CN組）開展試驗。FN組的試驗方法為：在掛膜裝置內放入濾片和注入海水后，1～5 d，添加發酵營養液每天1次200 g（以飼料干質量計），持續開啟機械攪拌裝置；6～10 d，關閉機械攪拌裝置，開啟氣泵充氣，添加掛膜菌劑每天1次40 mL，監測水體氨氮和pH，直至氨氮質量濃度降至小于0.2 mg/L。隨后再次連續5 d添加掛膜菌劑每天1次40 mL，并開啟電磁隔膜計量泵，添加化學營養液，模擬日常養殖過程中投飼后的氨氮產生過程，于9：00—11：00、15：00—17：00、21：00—23：00開啟添加泵，其余時刻關閉添加泵，添加頻率為2沖程/min。CN組的試驗方法為：添加濾片和海水后，1～5 d，開啟電磁隔膜計量泵添加化學營養液，每日添加的時間段與前述一致，添加頻率為6沖程/min（與飼料提供的氮量近似），開啟機械攪拌裝置，隨后試驗方法與FN組相同。每日于9：00前檢測FN組和CN組的pH、氨氮、亞硝酸鹽氮，每隔15 d拍照記錄濾片顏色，并用體視顯微鏡記錄內部生成物變化情況。需要注意的是，如果試驗過程中出現pH顯著降低或者低于7.5的情況，應及時添加補充碳酸氫鈉。試驗結束后，采集掛膜好的濾片進行微生物分類測序分析，獲得微生物組成和多樣性數據。

1.3 試驗環境、裝置及配套設備

所有試驗裝置集中布置于長6 m、寬5 m、高2.5 m的雙層不透光膜結構保溫棚中。保溫棚位于地下一層實驗室，保持黑暗環境。

掛膜裝置為2口直徑1.8 m、高1.0 m的管架圓池。池壁為PVC刀刮布材質，在池的上部和底部均有排水口。池底布設6個曝氣盤，呈環形均勻分布，曝氣盤為直徑30 cm的橡膠膜片曝氣盤，橡膠蒙皮，橡膠上打有直徑3 mm的小孔。充氣泵采用日升LP-100型氣泵，標稱供氣量為140 L/min，出口氣壓為0.042 MPa。試驗池內液面高80～90 cm，容積約2 m3，在該水壓下（0.008～0.009 MPa）的出氣量為132～138 L/min。為確保加入濾片后水體仍能呈現充分流動狀態，掛膜池配備2臺氣泵進行供氣。氣泵位于保溫棚外，以確保氣泵打入的是新鮮空氣。掛膜期間，保證裝置和設備正常運行，除攪拌試驗外其余時間均開啟兩臺充氣泵，保證溶解氧充足（＞5 mg/L）。

控溫裝置為杭州亞仕邦泵業有限公司生產的ACW-3000型冷暖水機組，壓縮機功率2 200 W，制冷量8 540 W，制熱量9 000 W，循環水量3 000 L/h。通過循環泵將掛膜池內的水泵入控溫裝置進行水溫調節。掛膜期間，控制掛膜裝置內水溫在（26±2）℃。

儲備和調配水裝置為長2.65 m、寬0.8 m、高0.9 m的玻璃水族缸。

化學營養液添加裝置為SEKO電磁隔膜加藥泵，型號為DMS200，流量9 L/h，最大頻率160沖程/min。營養液桶為上底直徑0.85 m、下底直徑0.65 m、高0.85 m的柱形PP桶，容積350 L。

機械攪拌裝置采用市售的液體加藥攪拌機，型號為BLD09-0.75 kW，輸出轉速為130 r/min，槳葉直徑30 cm，襯塑材質。定制不銹鋼架，將攪拌機安裝固定于掛膜裝置的管架圓池中央，槳葉伸至距池底50 cm處。

1.4 投入品配方及配制方法

投入品包括試驗用水、海水、化學營養液、發酵營養液、掛膜菌劑。其配方及配制方法如下：

試驗用水為試驗場地的自來水。使用常州金壇保嘉海水晶廠生產的速溶海水晶（養殖專用鹽）配制海水。該海水晶基于Schmatz的人工海水配方配制，其主要原料成分見表1。參照Lake Products Company LLC的ASTM D1141—98人工海水配方［36］，添加六水合氯化鍶0.095%，硼酸0.071%，即每kg海水晶添加六水合氯化鍶（國藥，分析純）0.95 g和硼酸（國藥，分析純）0.71 g。配制方法為：自來水加滿后，添加速溶海水晶（保嘉牌養殖專用鹽，上海保嘉工貿有限公司生產）約50 kg（水的密度調整為1.024 g/mL）、23.75 g六水合氯化鍶和17.75 g硼酸，利用開孔管曝氣12 h，至完全溶解，并利用曝氣去除游離氯氣，隨后靜置24 h以上備用（后文稱“熟化海水”）。熟化海水的成分及與天然海水［37］的成分對比見表2。除碳酸根離子和溴離子外，試驗海水與天然海水成分近似。

化學營養液的配方參見Watson 1989年描述的海棲亞硝化細菌和硝化細菌的無機營養配方［38］?？紤]到海水中的大量元素如Na、K、Ca、Mg已經很充足，在本配方中不做添加補充，僅考慮補充磷酸根、螯合鐵離子、鉬酸根以及錳、鈷、銅、鋅。同時，考慮到磷酸氫二鹽的溶解度非常低，且易于與其他陽離子發生沉淀，因此不適宜作為溶液添加。參考國外的人工海水配方［39］，其中添加了磷酸二氫鉀（鹽度18，終濃度0.37 mmol/L），維生素B12（鹽度18，終濃度0.1 μmol/L），以及螯合鐵和金屬復合溶液（含鐵、錳、鋅、鈷），而未添加鉬酸根。綜合以上信息考慮，可依據培養基配方中的氨氮濃度來補充磷酸二氫鉀、螯合鐵和復合微量金屬元素、維生素B12、復合維生素。經查詢，禮藍（上海）動物保健有限公司生產的“速補100”可以補充金屬類微量元素（鐵、錳、鋅、鈷、銅，其中鐵含量4 000 mg/kg），“德維樂”可補充微量維生素，因此在本培養基中添加補充適量的磷酸二氫鉀、“速補100”（禮藍上海公司購買）、維生素B12和“德維樂”（禮藍上海公司購買），以氨氮濃度計算的每克氨氮的營養物質添加量見表3。氯化銨和碳酸氫鈉使用電磁隔膜加藥泵添加，方法為：配制成氨氮質量濃度為4 500 mg/L的溶液300 L，溶液中添加約3倍質量的碳酸氫鈉，充分攪拌溶解備用。該型號加藥泵在試驗安裝位置條件下，每個沖程的添加量為1.2 mL。使用智能控制開關調節設備運行時間段，通過調節設備每分鐘的沖程數來調節日添加量?？紤]到配方中其他物質用量較少，掛膜池中1.8～2.0 t的水即可稀釋至很低濃度，因此，其他物質按照上述劑量用一定量的水完全溶解后，均勻潑灑于掛膜池中，至下次配制營養液時再添加相同劑量的該類物質。

發酵營養液的制作過程為：將魚苗飼料（天馬牌，粗蛋白質質量分數43%）用粉碎機打碎至粉末狀，用5倍體積的水充分浸泡并攪拌至稀糊狀，添加奧利安（湖北）生物工程有限公司生產的混合型飼料添加劑（枯草芽孢桿菌+糞腸球菌+釀酒酵母V型）和上海亞寶水產科技有限公司生產的EM菌產品（含乳酸菌、酵母菌、硝化菌、放線菌、光合細菌和芽孢桿菌），攪拌均勻后，在黑暗處常溫發酵2～3 d備用。奧利安飼料添加劑和EM菌的使用量為飼料干質量的1%～2%。

掛膜菌劑選用深圳長隆、武漢水之國和沈陽某廠家的耐鹽硝化細菌，硝化細菌均為液體包裝，冷藏低溫運輸至實驗室后，置于2～8 ℃冰箱中備用。

1.5 分析指標及檢測方法

水體氨氮、亞硝酸鹽氮含量和pH均采用奧克丹水質分析儀進行檢測，檢測試劑由奧克丹公司提供，待測樣品體積為4 mL。在檢測較高濃度的氨氮和亞硝酸鹽氮時，可以先進行稀釋，一般氨氮稀釋20～40倍，亞硝酸鹽氮稀釋20～200倍。檢測前對標準曲線進行校準，氨氮校準方法參照《水質 氨氮的測定 納氏試劑分光光度法》（HJ 535—2009），硝酸氮檢測參照《海洋調查規范海水化學要素觀測》（GB/T 12763.4—2007），校準用設備為普析1810PC紫外分光光度計。pH使用電極法測量，使用梅特勒托利多 FE20實驗室pH計校準。氨氮（100 μg/mL）標準試劑和亞硝酸鹽氮（100 μg/mL）標準試劑購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心。

濾片的觀察和記錄使用江南體視顯微鏡（JSZ5BS）。濾片顏色的拍攝在體視顯微鏡的白色載物臺上進行。

樣品的微生物測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，OTU聚類分析及物種組成分析由BBI生信云V1.0依據測序數據自動分析。具體方法為：使用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit對掛膜完成后的2個樣品進行DNA抽提，提取掛膜載體上的微生物總基因組DNA，完成后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。以V1～V3區特異性引物V1F（5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3）和V3R（5-CACGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3）［40］進行PCR擴增，采用Illumina Miseq對PCR擴增產物進行測序。聚類分析時，OTU序列相似度為0.97，物種分類方法為rdp/16S［41］，將相對豐度＜0.1%的物種合并為others組。

2 結果

2.1 攪拌試驗結果

攪拌組（S1組）：攪拌機運行5 min后，所有濾片即被帶動進行流化運動，當攪拌停止時，約有12 cm厚的濾片露出水面；攪拌機運行1 d后，所有濾片均處于良好的流化狀態，當攪拌停止時，約有10 cm厚的濾片靜止浮在水面上方；攪拌機運行3 d后，所有濾片均處于良好的流化狀態，當攪拌停止時，大多數濾片仍隨著水流做翻滾運動，至水體完全靜止時，僅有約1 cm厚的濾片浮在水面上方；攪拌機運行7 d后，所有濾片均處于良好的流化狀態，當攪拌停止時，大多數濾片仍隨著水流做翻滾運動，至水體完全靜止時，僅有100余片濾片完全浮于水面上方，其他濾片均浸沒在水體中。

不攪拌組（S0組）：當氣泵開啟時，位于充氣出口上方直徑約35 cm的圓形區域的濾片處于良好的流化狀態，其余位置的濾片均處于相對靜止狀態；7 d后，濾片的狀態與1 d時相似。

2.2 掛膜試驗結果

2.2.1 氨氮和亞硝酸鹽氮

掛膜試驗期間氨氮和亞硝酸鹽氮質量濃度的變化情況見圖2。

發酵營養組（FN組）：試驗開始后1～10 d，氨氮濃度上升速度較慢，第11天時氨氮濃度達到峰值（20.36 mg/L），第14天開始下降，并于第27天時氨氮質量濃度降至0.10 mg/L，此時亞硝酸鹽氮質量濃度升至21.15 mg/L，第28天開始持續添加化學營養液，至第38天時，亞硝酸鹽氮質量濃度上升至最高，為45.28 mg/L，隨后以每日9.60～11.76 mg/L的降幅連續下降3 d，至第46天時，亞硝酸鹽氮質量濃度下降為0.10 mg/L，隨后，水體氨氮和亞硝酸鹽氮均處于極低水平（＜0.1 mg/L）。

化學營養組（CN組）：試驗開始后1～5 d，氨氮濃度上升速度較快，且與化學營養液的日添加量呈明顯的線性關系，第6天時氨氮質量濃度達到峰值（25.12 mg/L），隨后于第9天時開始緩慢下降，第14天開始快速下降，第22天時氨氮質量濃度已降至0.10 mg/L以下，從第23天開始持續添加化學營養液，至第40天時，水體亞硝酸鹽氮質量濃度達到最高，為53.20 mg/L，隨后以每日2.54～7.30 mg/L的降幅連續下降7 d，至第56天時降至0.10 mg/L。

2.2.2 濾片顏色

掛膜過程中各試驗組濾片顏色的變化情況見圖3。FN組的濾片（后文稱FN濾片）顏色隨著掛膜時間的增加逐漸由黃色轉為褐色，CN組的濾片（后文稱CN濾片）也有相似的變化趨勢，但是同一時間點FN濾片的顏色均較CN濾片的顏色深。在試驗第60天時，CN濾片上帶有顏色的物質有部分脫落現象，表明CN濾片的掛膜牢固程度較差。結合氨氮和亞硝酸鹽氮的檢測結果來判斷掛膜情況，當FN濾片掛膜完成時（約45 d）的顏色與CN濾片掛膜完成時（約60 d）的顏色相似。

2.2.3 濾片孔隙生成物

掛膜試驗過程中濾片孔隙生成物的情況見圖4。由于FN組采用了發酵營養物質，水體顏色呈淺棕色，因此在后期的檢查中FN濾片孔隙周圍的顏色均較CN濾片深。第15天時，FN濾片內仍有一些殘留的微小飼料顆粒，CN濾片則較為干凈；第30天時，FN濾片視野內已可見大量菌絲狀生成物，CN濾片視野內則僅見零星位置有菌落狀生成物；第45天時，FN濾片視野內的孔隙表面幾乎完全被一層棕黃色生物膜覆蓋，CN濾片視野內也可見零星分布的黃色生成物；第60天，FN濾片視野內的孔隙表面棕黃色生成物明顯增厚，CN濾片視野內零星分布的黃色生成物也有增加，但仍有部分區域裸露出濾片原有的白色。

2.2.4 微生物群落組成分析

本次試驗分析共計鑒定出105個分類操作單元（operational taxonomic unit， OTU），其中FN組和CN組共同享有67個OTU，FN組總計鑒定出92個OTU，獨有25個OUT；CN組總計鑒定出80個OTU，獨有13個OTU。

門水平下的群落組成結果見圖5。結果顯示，變形菌門、擬桿菌門和浮霉菌門在兩個樣品中的占比均超過3%，且排序相同。另外，樣品中也有檢出放線菌門和疣狀微生物門細菌。

綱水平下的群落組成結果見圖6。各組中，α變形菌綱占比超過45%，占絕對優勢。FN組中腐敗螺旋桿菌綱及β變形菌綱占優勢，占比分別為22.0%和11.4%；CN組中γ變形菌綱及黃桿菌綱占優勢，占比分別為25.3%和9.7%。

屬水平下的群落組成結果見圖7。FN組中，紅桿菌科（Rhodobacteraceae）某屬占比為24.7%，占絕對優勢；其次是腐敗螺旋菌目（Saprospirales）某屬，占比21.9%；然后是亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas，占比10.7%）和硝化桿菌屬（Nitrobacter，占比8.1%）。CN組中，海桿菌屬（Marinobacter）占絕對優勢，占比為16.7%；其次是假氨基酸桿菌屬（Pseudaminobacter，占比10.4%），硝化桿菌屬占比6.9%，亞硝化單胞菌屬占比5.7%。

2.2.5 硝化細菌組成分析

樣品中硝化細菌的組成及序列數見表4。在FN組中鑒定出4個OTU的亞硝化細菌屬細菌，而CN組中僅鑒定出2個OTU，檢出序列數也明顯低于FN組。

3 討論

3.1 浸沒狀態改進

MBBR中的載體依靠曝氣和水流的提升作用處于流化狀態，但在實際工程中，容易出現局部載體堆積的現象［42］。攪拌試驗的結果也顯示，在僅曝氣的條件下，1周后，MBBR中的濾片仍大量堆積在頂部，而未能浸沒在水中。在增加攪拌的條件下，濾片能夠很好地浸沒在水中。攪拌和曝氣都是移動床生物膜反應器中常見的讓載體流化的裝置，曝氣大多用于好氧裝置，攪拌大多用于厭氧裝置［43］。RAS中涉及的硝化反應的MBBR大多是好氧裝置［3］。本試驗將MBBR中通用的攪拌裝置應用于硝化掛膜過程中來解決濾片堆積的問題，加速流化進程，取得了良好的效果。能夠浸沒在水中自由懸浮，標志著濾片已完成了流化。據分析推測，由于流化后濾片表面的微氣泡被去除，改善了親水性，將更有利于硝化細菌的附著。因此，后續試驗選擇經攪拌浸水后的濾片，也有助于加快掛膜進程。

3.2 海水配方與營養物配方

大多數與海水養殖MBBR系統有關的試驗均采用天然海水［6，44］。本試驗結果顯示，使用經改進的商業海水晶配制的海水，其主要成分與天然海水接近，掛膜結果表明，人工海水未對掛膜產生不利影響。商業海水晶配方的主要區別在于微量元素的不同［45］。本試驗將掛膜過程中的投入品分為了人工海水和營養物質，其中人工海水基于Schmatz配方，只包含大量元素，由于這種商業海水晶的價格較低廉，這也為將來實際應用中大批量人工海水掛膜提供了一種較為經濟的途徑。

添加的營養物質一般為氮源和生長消耗物質。除了使用碳酸氫鈉和氯化銨外［31］，一些研究采用海水魚養殖過程中的糞便和飼料按比例與海水混合后的物質作為營養物質，獲得了較好的掛膜效果［6，34，44］。本試驗采用兩種商業菌劑與飼料發酵形成的發酵營養物，獲得了比單純使用氯化銨試劑更快的掛膜速度和更穩定牢固的掛膜效果。

本試驗中的化學營養物中額外添加了磷酸鹽。由于硝化細菌體組成中的含磷量僅為含氮量的1/11左右，因此硝化細菌種群的擴大需要大量的磷［43］。在實際生產中，水產動物的糞便和飼料中均含有比較豐富的磷，所以一般以這些物質為營養的掛膜試驗中，磷不會缺乏，但是若純粹使用化學試劑來配制營養液，則需要考慮添加磷酸鹽以補充磷。

濾片顏色變化的結果顯示，使用發酵營養物的FN濾片上帶有顏色的物質較不易脫落。從孔隙生成物的情況看，FN濾片中存在與CN濾片不同的絲狀菌落。研究顯示，在生物膜組成菌種中，放線菌（放線菌門）可以抵御剝落［40］，且放線菌可以存在于高鹽環境中［46］。但本試驗中，最終濾片上的微生物占比較多的屬主要來自變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）。結果提示，在營養物質中添加放線菌并不會增加濾片上的放線菌，另外，抵御剝落的細菌可能不僅來自于放線菌門，還來自于變形菌門和擬桿菌門，這還需要進一步研究。

在RAS中添加營養物質還須考慮引進外來菌種的風險［6］。通常在海水養殖系統中，營養物發酵后將面臨高鹽環境，且在后期將遭遇高亞硝酸鹽的環境。國標顯示，食品中亞硝酸鹽含量約20 mg/kg（肉罐頭約50 mg/kg）可達到防腐要求，且在人的安全食用范圍內［47］。本試驗中，亞硝酸鹽氮質量濃度最高峰值為45.28～53.20 mg/L，因此可以不用考慮外來菌種帶來的風險。

3.3 掛膜指標選擇與時間窗口

掛膜成功的標志是氨氮處理能力良好，且亞硝酸鹽開始有正向處理能力［48］。本研究中氨氮和亞硝酸鹽氮質量濃度的變化顯示，兩組濾片均掛膜成功。從亞硝酸鹽氮降至0.10 mg/L以下的時長看，FN組需要46 d，CN組則需要56 d。Li等［6］報道的最快掛膜時長為63 d。本試驗結果表明，采用攪拌+發酵營養+較全面的化學營養+多樣化菌種的策略可使掛膜時長縮短約27%，采用攪拌+較全面的化學營養+多樣化硝化菌種的策略可縮減時長11%，上述策略均能使濾片更快掛膜。

本試驗還獲得了濾片顏色變化以及孔隙生成物變化的指標，但是由于采用的方法和營養物質不同，無法與已有的文獻報道進行比較。在實際應用過程中，針對相同掛膜水質和養殖對象環境，可以建立濾片顏色變化及孔隙生成物變化的圖譜，使用圖譜來指導掛膜應用。

3.4 基于微生物群落多樣性的掛膜結果討論

有文獻表明，對海水掛膜濾片樣本進行測序分析，當序列數達到3.6萬～6.0萬時，有效的OTU為455～1 062［49］。本試驗中的序列數為2.0萬～2.3萬，有效OTU數量為80～92個，說明在實驗室條件下開展的利用發酵營養物或化學營養物實施掛膜，濾片上的細菌種群數量顯著低于實際養殖過程中使用的濾片。有學者研究了天然海水和人工海水中的微生物群落，結果顯示，與人工海水環境樣品相比，天然海水樣品具有更高的耐鹽和嗜鹽細菌多樣性［50］。因此，在實際養殖環境下使用天然海水實施濾片掛膜啟動可能會獲得更豐富的細菌多樣性。本試驗中，FN組濾片檢出的OTU數量較CN組高15%，說明使用發酵營養物有助于提升掛膜過程中細菌群落的多樣性。

已有的研究表明，利用海水掛膜的濾片上的微生物以變形菌門（30.27%～56.94%）、擬桿菌門（11.5%～17.21%）和浮霉菌門（5.81%～14.95%）為主，疣微菌門相對豐度較?。?5，49-51］，本試驗獲得了相同的結論。結果表明，雖然使用了不同的營養液來源，但最終獲得的掛膜濾片上的微生物門類及其占比類似。在綱水平上，趙越［44］的研究表明，α變形菌綱和γ變形菌綱細菌占優勢，與本研究獲得的結果相似。屬水平上，不同養殖環境中的優勢菌不同，主要優勢菌有unclassified_Rhodobacteraceae［49］，unclassified_Flavobacteriaceae［49］，亞硝化球菌屬［49，52-53］和硝化桿菌屬［26］，其中與氨氮處理有關的細菌為亞硝化球菌屬和硝化桿菌屬。有研究表明，海水環境中的亞硝酸鹽氧化均以硝化桿菌屬為主，淡水環境則以硝化螺旋菌屬（Nitrospirea）為主［26］。以上結果與本研究獲得的結果一致。結果表明，從濾片上微生物群落的組成和多樣性角度看，無論在門、綱、屬水平，最終獲得的濾片均與掛膜成熟的濾片類似。

本研究對不同營養組的亞硝化球菌屬和硝化桿菌屬的OTU數量進行分析，結果表明，與化學營養組相比，發酵營養組獲得的掛膜濾片上起硝化作用的細菌多樣性更豐富，且占比更高，這說明在實施掛膜啟動時，應多使用營養豐富的營養物質。

4 結論和展望

本研究結果表明，通過攪拌濾片，采用低成本的海水配方、專用營養液，以及選擇多樣化的菌種等方法和措施，可以實現人工海水條件下MBBR濾片的快速掛膜。建議在提供合適營養液的條件下逐步增加氨氮壓力，以獲得更高的氨氮處理能力，在使用本試驗裝置提高氨氮處理能力時，建議增加對硝酸鹽的監測，以使硝化細菌在良好的水環境下增殖繁育。

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Experimental study on rapid start-up of moving bed biofilm reactor with artificial seawater

YANG Jiping， GUO Liming， WANG Zhi， WANG Peng

（Shanghai Ocean Aquafarm Fishery Co.，Ltd.，Shanghai 200126，China）

Abstract： In the seawater recirculating aquaculture system， the biofilm formation time of moving-bed biofilm reactor（MBBR） is usually long.By using experimental strategies such as stirring filter，low-cost seawater formula，specialized nutrient solution and diversified bacterial strain selection，the rapid biofilm formation of MBBR filter under artificial seawater conditions was achieved，and an evaluation system based on ammonia nitrogen，nitrite nitrogen level，filter color，and pore products of filter was established.The fermentation nutrition group started up in 46 days，while the chemical nutrition group started up in 56 days.During the start-up process，the highest concentration of ammonia and nitrite was 20.36-25.12 mg/L and 45.28-53.20 mg/L，respectively.

Key words： recirculating aquaculture system; moving-bed biofilm reactor; biofilm formation; artificial seawater