牛白血病的分子診斷與基因治療

賽麗麥·穆門

摘要：牛白血病是由C型、致瘤病毒群、反轉錄病毒科、丁型反轉錄病毒屬的牛白血病病毒導致的一種可發生于瘤牛、水牛、普通牛中的疾病，全世界范圍內均可發生此病?；疾『笈Ｖ坏纳a性能下降，給廣大養殖戶帶來嚴重的經濟損失，因此準確掌握其診斷技術及治療方案至關重要。本文綜述了在分子層面診斷牛白血病的方法以及在基因層面進行治療的方案，以期廣大養殖戶能夠利用先進的技術減少此病的發生。

關鍵詞：牛；白血??；分子診斷；基因治療

牛白血病作為一種全世界均流行的、經常發生于各種牛中的慢性、致死性、腫瘤性疾病，其產生的危害極大，奶牛感染之后造成產奶量的下降，肉牛感染之后造成體重的減輕、生長性能的下降。感染此病的牛只的皺胃、右心耳、腸、子宮、腎臟、肺臟、肝臟等均受到侵害，隨著病情的發展最終導致牛只免疫功能下降、免疫應答受損，患其他疾病的風險增加。牛白血病的傳染源主要為感染牛白血病的動物，此病可以通過垂直（血液、胎盤、乳汁）或者水平傳播方式（血液、滲出物、組織的混合物）進行傳播，還可以通過昆蟲的叮咬（蠅等）進行水平傳播。到目前為止，此病仍在世界范圍內（波蘭、烏克蘭、澳大利亞、巴西）廣泛分布。我國自1978年首次報道此病之后，截止到2016年，通過對6個省份的奶牛、15個省份的肉牛進行檢測，發現牛白血病在奶牛個體、肉牛個體中的陽性率分別為49.1%、1.6%，說明此病在我國養牛場尤其是奶牛場中普遍存在。因此，掌握先進、科學、準確的分子診斷方式是判斷此病的基礎，而熟悉此病的基因治療方案至關重要[1]。

1 患病機理

當牛只感染牛白血病病毒后會通過影響牛只外周循環而導致患病，患病牛只頜下淋巴結、腹股淋巴結等多處體表淋巴結發生炎癥，隨著淋巴細胞的不斷惡性浸潤和增生，導致其血液系統、淋巴系統受到嚴重的損傷，接著骨髓組織、內皮系統等也發生病變，隨著病毒入侵的蔓延導致胃腸道系統也出現病變，表現為因食道無法擴張而出現吞咽、采食困難等癥狀，最終衰竭而亡[2]。從分子層面解釋為：當牛只感染牛白血病病毒后其病毒的基因會整合在牛只的染色體中，導致牛只終身帶毒。在牛只體內反轉錄酶的作用下，牛白血病病毒合成一條DNA分子鏈以用于與病毒的RNA進行雜交，在DNA聚合酶的作用下形成具有雙股的DNA并進入到細胞核內，以整合到牛只染色體中，形成DNA前病毒；然后在RNA聚合酶的作用下，完成復制RNA病毒的核酸，并翻譯成病毒的外殼、反轉錄酶，以出芽生殖的方式將組裝成的病毒擴散到其他細胞中。此病毒攻擊的主要是牛只的B淋巴細胞，然后經過各種途徑之后造成其他細胞的感染，最終導致牛只的死亡[3]。

2 分子診斷

隨著科學技術的不斷進步和發展，分子生物學檢測牛白血病的方法具有靈敏度高、準確性好的優勢，且由于牛白血病病毒的基因可以整合到牛只細胞基因組中，其他方式幾乎無法檢測到牛白血病病毒基因組，故在檢測牛白血病病毒時分子生物學檢測逐漸取代了傳統的血液學檢測、血清學檢測、酶聯免疫吸附等方式，使從牛只的新鮮腫瘤或者外周血單核細胞樣本中檢測到牛白血病病毒的基因組成為可能。在診斷牛白血病病毒時常見的分子生物學技術包括聚合酶鏈式反應（PCR）、實時定量聚合酶鏈式反應（qPCR）技術、熒光共振能量轉移聚合酶鏈式反應（FRET-qPCR）等。

2.1 PCR技術

此技術是最普通的PCR檢測方式，也是最先被使用來進行牛白血病病毒檢測的分子生物學技術，具有加速檢測流程、敏感性、特異性強的優勢。此技術主要是對牛白血病病毒的前病毒DNA進行檢測。具體操作流程如下：采集或者使用在-80 ℃冰箱保存的牛只全血樣本；根據NCBI網站查找已經報道過的關于牛白血病病毒的基因序列，并利用Primer 5.0設計特異性的引物（即引物設計）；用已知陽性牛只的血液樣本和購買的DNA病毒提取試劑盒將樣本中病毒的DNA提取出來，并根據提出的DNA作為模板進行PCR擴增，所使用的試驗條件為在95 ℃下預變性5 min。進入循環：在95 ℃條件下變性45 s，56 ℃條件下退火35 s，72 ℃條件下延伸30 s，一共進行35個循環；之后在72 ℃條件下延伸10 min，結束之后觀察電泳結果，發現在牛白血病病毒陽性的樣品中擴增出了大小為194 bp的目的片段，故說明使用前病毒DNA樣本的PCR技術能夠準確檢測出牛白血病病毒[4]。

2.2 實時定量PCR技術

此診斷技術能夠彌補由于酶聯免疫吸附或者其他檢測方式由于牛白血病病毒相關抗體、抗原含量低而導致陰性的結果，檢測陽性樣本時僅需3個拷貝數。具體操作如下：首先要找到牛白血病病毒的基因序列，推薦使用的是Gen Bank數據庫；然后進行篩選，從基因庫中選出高度保守的區域，并選擇出具有特異性的基因序列，通過使用FAM熒光、MGB標記的方式對上下游進行標記以此來設計探針引物；接著使用實時熒光PCR反應來確定標準曲線（即Ct值與濃度之間的線性關系）；最后根據標準曲線擴增出關于牛白血病病毒長度為79 bp的特異性片段[2]。

2.3 熒光共振能量轉移PCR技術

此技術具有穩定性好、靈敏度高、不擴增其他牛常見病原體的優勢，且可以檢測牛只血液、陰道分泌物、牛奶、糞便中的牛白血病病毒，但是檢出率最高的是檢測血液中的病毒。具體操作如下：設計并合成FRET-qPCR引物和探針，通過利用GenBank數據庫和利用Clustal multiple alignment algorithm軟件分別找到牛白血病病毒的全基因序列和其中的保守區域以此來設計一對引物和探針；制備陽性對照，即是根據牛白血病病毒中的pol基因中的目的片段合成質粒并在大腸桿菌中表達；通過使用Hind Ⅲ限制性內切酶對質粒進行線性化；根據PicoGreen算法對已經線性化的質粒中的雙鏈DNA進行定量和稀釋并獲得標準曲線以計算樣品濃度；建立FRET-qPCR反應所需的條件；最后根據FRET-qPCR擴增曲線和高分辨率溶解曲線對得到的試驗結果進行判斷（Ct值＜30時且此時得到的Tm值在60～62 ℃之間則判定為陽性）。使用此方法得到的奶牛血液中的陽性率最高，為75.2%；陰道分泌物的陽性率次之，為49.5%；牛奶中的陽性率為46.7%；糞便中的陽性率最差為7.6%。且若血液中檢測結果為陰性的牛只，同一頭牛其他三個部位的樣品檢測結果也為陰性[5]。

3 基因治療

目前尚未研發出治療牛白血病的特效藥，因此常用基因治療的方式來治療種用價值或者其他價值較高的牛只，對于一般牛只若患有白血病之后則采用淘汰的方式進行處理?；蛑委熓菍⑼庠凑５幕驅氲脚Ｖ话屑毎赃_到糾正或者補償缺陷基因、異?；虻哪康?，從而實現對牛只的治愈。在治療牛只白血病時常用的基因治療技術包括RNA干擾技術。

RNA干擾技術的原理是在牛只細胞中導入與內源性mRNA編碼區某段序列同源的雙鏈RNA從而使內源性的mRNA發生降解，最終達到使牛白血病基因沉默的目的。此技術具有特異性強（只引起特定基因的降解而不會引起其他基因的沉默）、效率高（在治療過程中只需少量的同源的雙鏈RNA即可有效抑制靶基因的表達，且進行方式是催化放大）、可進行傳播（即可以在細胞群落之間進行傳播，注射到某個部位之后進而傳播到整個機體）、穩定性高（雙鏈的RNA性質穩定，不需要進行修飾）、遺傳性好（當在父母代中注射雙鏈RNA后，其子一代中也存在同樣基因抑制的現象）等優勢。

4 預防措施

對于牛白血病常見的預防措施包括定期檢疫、定期驅蟲、嚴格引種等。

4.1 定期檢疫

由于此病的潛伏期較長，且對于患病的牛只尚無特效藥進行救治，因此做好定期檢疫是預防此病發生的重要措施之一。當牛只患白血病之后，其最典型的特征就是血液中的淋巴細胞數量增多明顯，因此，可以通過定期對全群的牛只以全檢或者抽檢的方式來檢測血象變化，當牛只血液中白細胞超過70%的增量且發生異常增生時即可確診為白血病。而定期檢疫的時間一般為2～3個月；對于檢疫結果為陽性的妊娠母牛，其所產犢牛應該單獨隔離飼養至6月齡以上。對于確診的牛只要及時進行淘汰和撲殺，以此來慢慢實現對牛群的凈化[6]。

4.2 定期驅蟲

由于牛白血病可以通過吸血昆蟲、蚊蠅等進行機械性的傳播，因此牛群驅蟲工作實施的好壞直接決定了牛群的發病率。對于寄生在牛只體表（螨蟲、蜱蟲等）或者體內（線蟲、絳蟲、吸蟲）的寄生蟲，可以通過定期藥浴、飼喂驅蟲藥物（芬苯達唑伊維菌素片）的方式來驅蟲，一般藥浴選擇在天氣晴朗、溫度適宜的夏秋進行；飼喂藥物一般選擇在早晨飼喂之前空腹灌服驅蟲藥以保證驅蟲的效果。對于圈舍內蚊蠅，尤其是炎熱多雨夏季更適合蚊蠅的滋生，此時需要每日打掃牛只排泄的糞便，并每周進行滅蠅，保證圈舍的清潔、干燥，破壞適合蚊蠅生存的環境。另外，也要及時處理圈舍周邊的雜草等，避免蚊蠅滋生。

4.3 嚴格引種

養殖場盡量堅持自繁自養的基本原則，減少從其他地區引入牛只或者使用精液。確需引種時，則需要對新引入的牛只進行單獨的隔離飼養，并在隔離期間多次進行牛白血病抗體的檢測以及血液中淋巴細胞的檢測，隔離期滿后確認未攜帶牛白血病病毒后再與原群進行混養。

5 小結

由于牛白血病是我國乃至世界范圍內危害比較嚴重的疾病之一，因此為了促進我國養牛業的健康持續發展，保證養殖戶的經濟效益，必須掌握牛白血病的分子診斷方式，發現有較高經濟價值的牛只患病后及時采取有效的基因治療方案，并通過定期檢疫、定期驅蟲以及嚴格引種等措施最大限度地降低此病的發生率。

參考文獻：

[1] 彭雅蘭.牛白血病病毒全長感染性克隆的構建和生物學特性研究[D].揚州大學，2022.

[2] 王麗紅.牛白血病的診斷和防治方法及措施[J].中國畜禽種業，2021，17（12）：66-67.

[3] 王瑞林.牛地方性白血病的診斷和預防[J].中國動物保健，2023，25（4）：48-49.

[4] 宮洪杰.牛白血病病毒的鑒定及防控[J].畜牧獸醫雜志，2022，41（4）：19-20.

[5] 楊奕.牛白血病病毒分子流行病學調查及其致病性的研究[D].揚州大學，2018.

[6] 紅華.牛白血病的診斷與防治[J].獸醫導刊，2021（1）：32.