碳青霉烯耐藥革蘭陰性桿菌的耐藥機制及抗菌藥物的研究進展

劉潔，趙建平

(1 內蒙古醫科大學內蒙古臨床醫學院，呼和浩特 010050;2 內蒙古自治區人民醫院檢驗科，呼和浩特 010010)

多重耐藥菌(Multi-drug resistent organisms，MDRO)是指同時對三種或三種以上臨床使用的抗菌藥物耐藥的細菌[1]，多重耐藥已經成為威脅人類公共衛生的重要問題。碳青霉烯類抗生素是一類非典型的β-內酰胺類藥物，是目前抗菌譜最廣、殺菌活性最強的抗生素，是一種細菌細胞壁合成的抑制劑，它們可通過抑制胞壁黏肽合成，使細菌胞壁缺損、細胞裂解和死亡，從而殺滅細菌[2]。此類抗生素對各種革蘭陽性球菌、革蘭陰性桿菌、厭氧菌及多重耐藥菌都具有較強的抗菌活性，特別是對超廣譜β-內酰胺酶(Extended spectrum β-lactamases，ESBLs)和頭孢菌素酶(AmpC酶)具有高度穩定性、低毒性的特點，是治療嚴重細菌感染最重要的抗菌藥物之一[3]。近年來，由于過量和不正確地預防性使用廣譜抗菌藥物、激素和細胞毒性類藥物，尤其是一些合并多種疾病的老年患者，不合理用藥情況更為常見，其中最需要關注的是碳青霉烯耐藥革蘭陰性桿菌(Carbapenem-resistant organism，CRO)的出現[4]。CRO主要包括碳青霉烯耐藥腸桿菌目細菌(Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE)、碳青霉烯耐藥鮑曼不動桿菌(Carbapenem-resistantAcinetobacterbaumannii，CRAB)和碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌(Carbapenem-resistantPseudomonas aeruginosa，CRPA)三種，已被確定為全球威脅嚴重的耐抗生素病原體[5]。隨著此類抗生素的廣泛使用，CRO在全球范圍內擴散[6]，導致臨床選擇抗菌藥物越來越艱難，給臨床治療帶來了極大的挑戰。亞胺培南于1985年首次上市，是第一個可用于治療細菌感染的碳青霉烯類抗生素[7]。在隨后的二十年里，幾種碳青霉烯類抗生素被開發出來，現在臨床上使用最多的碳青霉烯類是厄他培南、美羅培南、多利培南和亞胺培南[8]。然而，在它們使用后不到十年CRO就出現了。由于碳青霉烯類抗生素是首選抗生素，并且在許多情況下是多重耐藥的最后治療手段，CRO出現和傳播是目前全球公共衛生的一個重大危機[9]。因此，在缺乏新抗生素和新治療選擇的情況下，加強對細菌耐藥性監測，加深對細菌耐藥機制的了解，合理地使用現有抗生素提高臨床療效，減少不良反應等策略，是控制CRO感染的主要手段。

1 CRO的耐藥機制

細菌對碳青霉烯類耐藥機制見表1，編碼這些機制的基因存在于不同的可移動元件上具有高度的可傳播性[21]，因此對抗菌治療帶來極大的威脅。

表1 碳青霉烯類藥物的耐藥機制

1.1 碳青霉烯酶的產生

常見的碳青霉烯酶根據Almber分類法根據β-內酰胺酶的中心催化結構域和底物偏好將其分為4類(即A、B、C、D)。其中，A類、B類和D類酶可水解碳青霉烯類藥物活性被稱為碳青霉烯酶，而C類酶它們對碳青霉烯類的水解活性很弱或不存在，但在外膜通透性降低的情況下，它們的過量產生可能導致碳青霉烯耐藥[22]。A類、C類和D類酶為絲氨酸碳青霉烯酶是使用絲氨酸作為酶活性中心，B類酶是金屬β-內酰胺酶(MBLs)而是使用金屬鋅作為酶活性中心[23]。

1.1.1 A類碳青霉烯酶

A類為絲氨酸蛋白酶，有染色體編碼的(SME，NMC-A，SFC-1，Bicc-1，PEN-A，FPH-1，SHV-38)，質粒編碼的(KPC，GES)，或兩者都編碼(IMI)，其中KPC在世界各地傳播，并從腸桿菌目細菌尤其在耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CarbapenemresistantKlebsiellaPneumoniae，CRKP)中檢出，是CRKP耐藥的主要原因。KPC的存在最初只在肺炎克雷伯菌分離株中，隨后KPC在巴西的銅綠假單胞菌和中國及其他區域的鮑曼不動桿菌中均有發現[24]。目前發現的KPC亞型有20多種，以KPC-2、KPC-3最常見。我國于1996年[10]首次分離到KPC型菌株，此后主要以KPC型為主，隨后其在全球范圍內迅速傳播。2014年攜帶 KPC-2型腸桿菌目細菌于土耳其一家醫院發現。產生KPC的肺炎克雷伯菌在美國廣泛存在，但在一些歐洲國家如希臘和意大利也被發現[25]，并引起世界范圍內的許多重大疫情。除KPC型在世界范圍內流行廣泛外，其他各型偶爾可見。

1.1.2 B類β-內酰胺酶

B類β-內酰胺酶或金屬β-內酰胺酶(MBLs)通常在腸桿菌目和銅綠假單胞菌中發現。到目前為止，已經報道了B類酶包括NDM、IMP、VIM、GIM和SPM酶等，其中NDM、VIM和IMP是全球最常被發現的酶[11]。2010中期年首次在肺炎克雷伯菌感染患者中檢測到NDM，該菌株導致1名印度裔瑞典患者的尿路感染[26]，自此以后NDM迅速傳播，這種金屬酶型已成為全世界最主要的金屬酶類型之一，主要見于腸桿菌目，特別是大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中，不動桿菌屬中也有少量發現，產IMP的革蘭陰性菌主要分布在中國、日本和澳大利亞，以鮑曼不動桿菌為主。VIM型在歐洲和地中海地區檢出率較高，主要由銅綠假單胞菌產生，大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌也可產生[27]。

1.1.3 D類碳青霉烯酶

D類碳青霉烯酶是一種水解囊狀酶又稱苯唑西林酶(OXA)，是β-內酰胺酶的一個異質性群，具有顯著的碳青霉烯酶活性。D類碳青霉烯酶的種類繁多以OXA-48和OXA-23為主，具有較強的水解活性，此類酶最早發現于鮑曼不動桿菌，也可見于腸桿菌目和非發酵菌中[12]。特別是OXA-48及其相關變異更具有臨床意義，它們使治療感染變得困難。有文獻報道OXA型在鮑曼不動桿菌中最常見，我國鮑曼不動桿菌以OXA-23型為主[28]。2001年，在土耳其的肺炎克雷伯菌分離株中鑒定出OXA-48基因，其分離株具有超強毒力的遺傳屬性，并因其耐藥性可導致嚴重感染且無法治療[29]。另外，OXA酶水解碳青霉烯類抗生素的作用較弱，因此需要聯合其他耐藥機制。

1.2 外膜孔蛋白的缺失

孔蛋白[13,30]是指存在于細菌外膜的通道蛋白，它以跨膜β-桶蛋白的形式存在，營養物質和抗生素可通過該通道進入細菌，是一種非特異性跨膜蛋白，允許抗菌藥物分子進入細菌內結合相應蛋白發揮作用，當細菌的菌體發生突變使外膜孔蛋白缺失或者減少時，最終導致抗菌藥物分子進入菌體內的數量減少，從而導致細菌耐藥[14]?？椎鞍卓煞譃槿悾嚎股剞D運相關的特異性孔蛋白(LamB和YddB等)、膜完整性相關的非特異性孔蛋白(OmpA)以及與抗生素轉運和細胞膜完整性有關的孔蛋白(OmpC和OmpF)。不同的細菌通過不同的通道發揮作用，文獻報道肺炎克雷伯菌的孔蛋白OmpK35和OmpK36對β-內酰胺類抗生素的作用優于大腸埃希菌的孔蛋白OmpF和OmpC，耐碳青霉烯大腸埃希菌表現為染色體攜帶的AmpC基因過度表達以及OmpC或OmpF4孔蛋白的改變，CRKP表現為OmpK35、36膜孔蛋白缺失，OmpK36突變[15-16]。

1.3 外排泵的過度表達

藥物主動外排轉運系統或外排泵是細菌膜上的一種蛋白質，外排泵系統的突變或過度表達可將抗菌藥物及其代謝產物從細菌細胞內向外輸出，從而導致細菌耐藥性的發生[17]。目前已有6個與臨床相關的外排泵家族：主要協助轉運蛋白超(MFS)家族、小多重耐藥轉運分子(SMR)家族、ATP結合盒(ABC)家族、多藥和有毒化合物排出(MATE)家族、蛋白桿菌抗菌化合物外排(PACE)家族和耐藥結節分裂(RND)家族。其中RND超家族普遍存在于在革蘭陰性桿菌中，其在耐藥中發揮著重大作用如AcrAB-To1C系統可介導β-內酰胺類抗菌藥物的耐藥，被認為是不產碳青霉烯酶CRE的耐藥機制；Cavalcanti等[18]報道MexAB-OprM和MexXY-OprM系統過表達可導致銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素耐藥和CRAB主要與RND超家族中AdeABC系統相關[17]。

1.4 藥物結合位點的改變

青霉素結合蛋白(PBPs)位于細菌細胞內膜上，是具有催化作用的一類酶，也是β-內酰胺類抗生素的靶蛋白可與細胞內膜上的PBP靶點特異性結合，從而干擾細胞壁肽聚糖的形成，最終導致細菌溶解[5]。PBPs可分為兩類：高分子量PBPs，主要負責肽聚糖聚合；低分子量PBPs，參與肽聚糖的成熟或循環[19]。PBPs的表達減少或突變導致MC值升高，突變可能在導致臨床耐藥的同時導致孔蛋白產量減少或碳青霉烯酶產量增加，從而發生細菌耐藥。

1.5 生物膜的形成

細菌生物膜(Bacterial biofilm, BF)對抗菌藥物和免疫反應具有較強的耐藥性，是黏附在生物或者非生物表面的微生物群落，包括蛋白質、細胞外DNA和胞外多糖，為細菌提供了一種保護性的生活方式[31]。BF生成早期，表面黏附會誘導細菌基因表達的變化，產生特定的BF，從而增加BF的耐藥性，之后BF基質中的胞外多糖成分可以削弱抗菌藥物的滲透力，并對宿主免疫細胞的吞噬作用提供屏障，阻止抗生素進入，使它們對抗生素和宿主的先天免疫成分更具抵抗力，造成抗生素出現藥物失效情況[20]。生物膜相關蛋白存在于CRAB胞外基質中，是CRAB生物膜形成過程中的關鍵蛋白。

2 CRO感染的抗菌藥物

CRO感染在世界范圍內普遍存在且耐藥譜覆蓋面廣，對于所有的β-內酰胺類抗菌藥物存在明顯的耐藥性，為臨床醫學疾病治療帶來了很大的難度。由于每一種新的藥物都有自己的優點和注意事項，抗菌藥物的合理使用發揮至關重要的作用。當前，國內外醫療對于CRO的疾病治療藥物通常有多黏菌素、替加環素、磷霉素或頭孢他啶/阿維巴坦[32]等。由于抗菌藥物之間可能存在協同效應，在治療藥物的選擇上，聯合用藥被推薦使用。

2.1 多黏菌素

多黏菌素是一種堿性多肽類抗生素，主要分為A、B、C、D、E5種，目前我國常用多黏菌素B(Polymyxins B, PMB)及多黏菌素E(Polymyxins E,PME)。多黏菌素可以與革蘭陰性桿菌外膜脂質A相互作用，導致細胞內容物外泄和細菌細胞死亡。對銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、腸桿菌目細菌(除了黏質沙雷菌、變形桿菌、普羅維登菌、摩根菌和哈夫菌)和一些嗜麥芽假單胞菌具有活性[33]。多黏菌素具有顯著毒性(腎毒性和神經毒性)，限制了其在臨床的應用[34]，多黏菌素對CRO有較強的抗菌活性，但存在異質性耐藥現象，不建議單獨使用，根據病原菌的不同、感染部位的不同及測得的藥敏情況，當需要使用黏菌素或多黏菌素B時，將其與至少1種其他不同類別的藥物進行聯合使用。

Zusman等[35]所完成的一項回顧性研究，對188例患者的死亡率進行了評估，多黏菌素單一療法與多黏菌素與碳青霉烯類抗生素聯合治療比較，其死亡率和病死率顯著低于單藥治療，因此支持聯合用藥。Samal等[36]研究報道，研究中有4863例患者被納入分析，體外研究表明，碳青霉烯類和多黏菌素之間存在協同作用，主要見于不動桿菌屬，克雷伯菌屬和假單胞菌屬，有高達50%的菌株顯示協同作用。黏菌素/多黏菌素B聯合使用的最常見的藥物是替加環素，因此對于CRO感染患者，推薦使用最佳劑量的多黏菌素聯合一種體外活性藥物，病情嚴重時，可聯合兩種活性藥物。

2.2 替加環素

替加環素是甘草環素類抗菌藥，是米諾環素的半合成衍生物。它與細菌核糖體結合，具有高度親和力，不受細菌對四環素類耐藥的典型機制的影響[37]。在CRO中，替加環素對大多數CRE、CRAB、CRKP都有活性，Chang等[38]報道，替加環素在治療嚴重感染方面并不比標準抗菌藥物更有效，且有試驗顯示，其具有一定的副作用，增加了患者死亡率的風險。此外，替加環素一般不推薦用于菌血癥，因為它具有抑菌活性，在當前推薦劑量下，血清中穩態濃度較低[37]。由于治療CRO感染的有效藥物稀缺，在沒有全面客觀評價的臨床用藥情況下，不能輕易地放棄替加環素，與黏菌素一樣，替加環素在治療對CRO感染時主要用于聯合用藥。易感菌譜的擴大、協同作用的潛力和耐藥發生率的降低是使用聯合治療的主要理由。Bartoletti等[39]研究發現替加環素聯合治療的30 d死亡率明顯低于單一治療，三聯用替加環素組的30 d死亡率明顯低于雙聯用替加環素組。這些結果表明，替加環素聯合治療CRE感染比單一治療更有效。

2.3 磷霉素

磷霉素是最早發現于1969年西班牙的老藥，其主要作為一種口服制劑，主要用于治療大腸埃希菌和糞腸球菌引起的尿路感染[40]。部分國家常使用靜脈注射磷霉素，用于治療各種革蘭陽性菌和革蘭陰性菌感染患者及多重耐藥菌患者，如肺炎[41]。然而，單獨使用磷霉素容易導致耐藥菌株的出現[42]。因此，磷霉素在臨床上經常與其他抗生素聯合使用，以減少耐藥突變的出現。

2.4 頭孢他啶/阿維巴坦

阿維巴坦是一種二氮雜環辛烷(DBO)β-內酰胺酶抑制劑，2015年被批準與頭孢他啶聯合用于治療復雜腹內感染(CIAIs)和復雜尿路感染(cUTIs)，隨后2018年起用于治療醫院獲得性和呼吸機相關性細菌性肺炎(HABP/VABP)[43]。頭孢他啶/阿維巴坦復方制劑是可以對抗ESBL和碳青霉烯酶引起的細菌耐藥性，阿維巴坦抑制Ambler A類KPC碳青霉烯酶和C類β-內酰胺酶以及D類部分苯唑西林酶(如Oxa-48碳青霉烯酶)[44]然而B類碳青霉烯酶(VIM、NDM)其不被阿維巴坦所抑制。Doi[45]報道，由于KPC基因的突變，10%的患者可能在使用該藥物治療時出現對頭孢他啶/阿維巴坦耐藥的KPC-肺炎。這些變異的KPC β-內酰胺酶不再能夠有效地水解碳青霉烯類化合物，但對碳青霉烯類化合物的敏感性，但這一觀察的臨床意義尚待明確[46]。有研究顯示頭孢他啶/阿維巴坦對一些CRPA菌株也有效[47]，銅綠假單胞菌對頭孢他啶/阿維巴坦的敏感性取決于影響外膜孔蛋白的改變、外排泵表達及β-內酰胺酶表達等多種耐藥機制的共存。但頭孢他啶/阿維巴坦對鮑曼不動桿菌或嗜麥芽桿菌無抗菌作用[48]。與黏菌素相比，頭孢他啶/阿維巴坦的高成本可能是其受限使用的主要原因。Onorato等[49]報道，頭孢他啶/阿維巴坦與老抗生素比較，它具有使用效果好、毒性更小的優勢，但面臨價格昂貴的挑戰。

2.5 亞胺培南/西司他丁或瑞來巴坦

亞胺培南/西司他丁或瑞來巴坦是一種新型的β-內酰胺/β-內酰胺酶抑制劑組合，可增強微生物活性，對抗多重耐藥革蘭陰性病原菌包括耐碳青霉烯類非摩根菌科腸桿菌目(CR-NME)和難治性耐藥銅綠假單胞菌(DTR-PA)[50]。瑞來巴坦是一種二氮雜雙環辛烷抑制劑，沒有直接的抗菌活性，但對Ambler A類和C類酶具有抑制作用[51]。亞胺培南聯合瑞來巴坦可恢復其對大量CR-NME和DTR-PA的體外活性，但對鮑曼不動桿菌或產MBLs的革蘭陰性菌(如NDM、IMP、VIM)、表達SME碳青霉烯酶的黏質沙雷菌沒有活性[52]。在美國和歐洲聯盟，沒有其他代替治療的情況下，該藥被批準用于成人院內獲得性肺炎、皮膚炎和其他耐藥病原體(主要是CRE和CRPA)引起的感染[50]。

2.6 頭孢洛扎/他唑巴坦(C/T)

頭孢洛扎/他唑巴坦(C/T)是美國食品和藥物管理局和歐洲藥品管理局批準的第五代頭孢菌素/β-內酰胺酶抑制劑組合[53]，C/T聯合治療對銅綠假單胞菌(包括耐碳青霉烯和耐多藥菌株)有強效抗菌作用，對腸桿菌目也有活性。C/T對不攜帶碳青霉烯酶的腸桿菌目分離株有超過75%的活性[54]。C/T聯合用藥治療銅綠假單胞菌感染的毒性低于多黏菌素或氨基糖苷類藥物[54]。Kanj等[56]發現，C/T 聯合甲硝唑對產ESBL腸桿菌目患者的臨床治愈率分別為95.8%和88.5%，與美羅培南具有非劣效性。

3 總結

CRO的耐藥機制是復雜的，其產碳青霉烯酶是最主要原因，通道蛋白的缺失、外排泵的過度表達和生物膜的形成等也是細菌耐藥性逐漸上升的重要原因，上述耐藥機制可能是單獨發揮作用也可能聯合發揮作用。針對特定的耐藥機制研發出新的抗菌藥物，這對于解決抗菌藥物耐藥性問題具有重要意義。CRO已成為21世紀的主要醫療負擔，為減緩碳青霉烯類抗生素耐藥性的產生必須采取預防措施，臨床醫生必須要提高藥物安全意識，合理使用抗菌藥物，以盡量延緩碳青霉烯類抗生素耐藥性的發展。