mtDNA細胞色素氧化酶-Ⅱ突變與胃癌相關性的研究

閆 斌， 韓麗紅， 于躍利

胃癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，其發病率位居人類腫瘤第二位(僅次于肺癌)，消化道腫瘤第一位。到目前為止，手術仍然是治療胃癌的最佳方法。而手術效果很大程度上依賴于早期發現、早期診斷。近年來，線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)突變與腫瘤的關系的研究越來越受到人們的重視，并且在多種人類腫瘤中都已檢測到mtDNA突變。本研究擬通過對胃癌組織mtDNA的細胞色素氧化酶-Ⅱ測序分析，了解中國人胃癌mtDNA的細胞色素氧化酶-Ⅱ的突變情況，以期為腫瘤的早期診斷及預防提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機收集2008年1月至2009年1月在包頭醫學院第一附屬醫院手術切除的胃癌組織標本50例，其中男性38例，女性12例，平均年齡56.44歲。均經病理科證實為胃癌。病理分期Ⅰ期11例，Ⅱ期2例，Ⅲ期8例，Ⅳ期29例。標本取回后于-80℃冰箱保存。

1.2 胃癌組織標本mtDNA的細胞色素氧化酶-ⅡPCR擴增 按照DNA提取試劑盒(Promgea公司)說明書提取50例胃癌組織的DNA。通過軟件分析設計出一對引物。上游引物: 5′-atggcacatgcagcgcaagt-3′，下游引物：5′-ggtaaatacgggccctatttc -3′。 PCR反應體系50 μL，水33.5 μL, 10×buffer(無Mg2+)5 μL,引物上下游各1 μL，4×dNTP 4 μL，25mM的MgCl24 μL ，Taq DNA聚合酶0.5 μL(試劑均來自Promega公司)，DNA模板1 μL。PCR反應條件： 94℃ 5 min； 94℃ 15 s，65℃ 30 s，72℃ 40s，35個循環。產物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，電壓120V，30 min。凝膠成像分析系統觀察記錄結果。

1.3 測序及分析 由百泰克公司使用ABI3730XL測序儀對PCR擴增產物進行測序。測序結果用Bioedit軟件進行分析,與GenBank序列(AC-000021)對比，在PubMed數據庫上進行氨基酸序列比對，確定是否為突變。

2 結果

細胞色素氧化酶-Ⅱ PCR擴增產物結果見圖1。50例胃癌患者中共有13例患者mtDNA細胞色素氧化酶-Ⅱ檢測到突變，突變率為26%，其中有1例在兩個位點上發生突變。類型以點突變G→A為主(表1)。在13例突變的胃癌組織中共有10個細胞色素氧化酶-Ⅱ突變位點,其中3個引起編碼氨基酸改變。

圖1 胃癌患者細胞色素氧化酶-Ⅱ PCR擴增產物電泳圖注：1—7 分別代表第1—7號患者胃癌組織PCR 擴增產物700bp,陰性對照為不加模板DNA 的PCR 擴增產物,以排除假陽性,Marker 是DL2000, 相對分子質量分別為100、250、500、750、1000和2000 bp。

突變位置突變類型編碼氨基酸例數7685T→C無意突變17705A→GY→C17763G→A無意突變17829A→G無意突變27850C→T無意突變17853G→A無意突變17854G→AV→I27860G→AD→N18021G→A無意突變38217C→T無意突變1

氨基酸代碼：Y酪氨酸，C半胱氨酸，V纈氨酸，I異亮氨酸，D天冬氨酸，N天冬酰胺

3 討論

腫瘤是一種在多因素作用下多基因受累并累積致使正常周期異常的細胞周期疾病。腫瘤的形成通常被認為與線粒體DNA突變和線粒體基因組功能的改變有關。既往對線粒體與腫瘤發生關系的研究主要集中在腫瘤細胞線粒體的形態和能量代謝等方面。隨著對mtDNA突變與腫瘤相關性研究的深入,發現在一些人類腫瘤細胞中,mtDNA可發生特異性改變,且與腫瘤的發生有關[1]。研究認為,mtDNA是致癌物作用的重要靶點,其損傷程度和突變率顯著高于核DNA ,與核基因交互作用是腫瘤發生的重要原因[2]。有研究表明在小鼠癌細胞系中使用胞質雜交技術代替內生的mtDNA,結果顯示mtDNA突變能夠通過提高癌細胞的轉移能力促進腫瘤的發生[3]。

mtDNA突變已在多種人類惡性腫瘤中被證實，mtDNA自身的易受損性和組成性的氧化壓力使其缺陷成為惡性細胞的重要特征之一。目前人們研究D-Loop區突變的比較多，本研究側重于研究細胞色素氧化酶-Ⅱ突變，國內鮮有報道。

凌賢龍等[4]的研究表明胃黏膜幽門螺桿菌感染可導致人類mtDNA 不穩及mtDNA的核內整合，mtDNA 核內整合可能在部分胃癌的發生中起重要作用，并推測這種整合至少可通過兩條途徑引起細胞癌變：(1)通過引起核基因組的不穩定發生癌變；(2)通過改變細胞能量產生，提高線粒體氧化壓力，引起線粒體酶表達異常和(或)調控凋亡等途徑來影響細胞的生物學行為，使其發生惡變。

細胞色素氧化酶-Ⅱ是細胞色素氧化酶的活性中心，包含1個CuA氧化還原中心，他具有不平常的分光特性,這個位點包含有2個銅原子，是細胞色素C電子傳遞的入口,也是細胞色素氧化酶電子泄露產生活性氧的主要部位,因此保持細胞色素氧化酶-Ⅱ的正常結構和功能對于維持正常的線粒體功能和細胞能量代謝具有重要作用。細胞色素氧化酶-Ⅱ的突變不僅導致突變部位附近殘基的側鏈結構環境發生極大的變化(包括電荷性質、親疏水性質和空間特性)，直接影響了酶復合物的形成，而且該酶幾個亞單位之間相互作用區域受到了影響,整個酶分子的穩定性大大下降[5]。大量證據表明，細胞色素C從線粒體釋放至胞質是引發凋亡的關鍵步驟。凋亡過程中細胞色素C的釋放是線粒體外膜通透性增高的結果[6]。線粒體在凋亡過程中起中心控制作用,而細胞色素C的釋放則是支配細胞命運的關鍵因素。有關這一信號途徑及其相關事件的認識，對進一步了解凋亡的正常生理和病理過程,及其在腫瘤中的失調控具有重要意義。當細胞色素C從線粒體釋放到胞漿后，細胞色素C傳遞復合物Ⅳ(細胞色素氧化酶)減少，而導致其上游的載體電子超載，尤其是復合物Ⅰ和Ⅲ,電子可能從呼吸鏈中逃逸出來，逃逸出來的電子就能和O2作用產生超氧陰離子。持續產生的超氧陰離子能轉變為H2O2和其他活性氧分子，活性氧分子具有化學活性和其他潛在的毒性，能使脂質發生過氧化、DNA氧化修飾、蛋白質氧化和酶的失活,引發廣泛的損傷效應,如引起生物大分子蛋白質和核酸等的結構和功能的改變,使細胞衰老和突變,誘發多種疾病,甚至引起癌癥[7]。

我們的研究顯示，胃癌患者中細胞色素氧化酶-Ⅱ突變率為26%，同時發現在胃癌發生中線粒體細胞色素氧化酶-Ⅱ突變與胃癌的發生有關系。這些改變中,究竟哪些是多態性,哪些是與疾病相關的突變,目前尚不清楚。這種突變的意義是正常多態性還是與胃癌密切相關也不清楚,結合文獻我們認為,突變導致編碼氨基酸的改變可能引起線粒體功能異常,從而對胃癌的發病產生一定影響。雖然根據我們的研究結果尚不能認為mtDNA突變在胃癌發病中起決定性的作用,但mtDNA突變可能是發病過程中的一個前期或伴隨現象,即這種突變可能在胃癌發病前就存在于體細胞線粒體,提高了發生胃癌的易感性。

總之，中國人胃癌中mtDNA突變是一個普遍的現象，他們在腫瘤的發生發展過程中可能起著重要的作用。細胞色素氧化酶在人體內分布十分廣泛，其突變與人類疾病發生有密切的關系,雖然可以檢測胃癌患者線粒體DNA編碼細胞色素氧化酶-Ⅱ的突變情況，但是突變位點氨基酸序列的改變、多肽疏水性的變化、蛋白質空間構想的改變等等，還有很多問題需要進一步研究。

[1] 秦曉琴,鄧艷春. 線粒體基因突變與腦膠質瘤的發生[J].中華神經外科疾病研究雜志,2009,8(1):89-91.

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[3] Ishikawa K, Takenaqa K, Akimoto M, et al. ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis[J]. Science, 2008, 320 (5876): 661-664.

[4] 凌賢龍，房殿春. 胃粘膜線粒體DNA 核內整合與bcl-2 和bax 表達的關系[J]. 重慶醫學，2003，32(9)：1129-1131.

[5] 蔡黔,周紅,徐淑芬,等. 過氧化氫導致線粒體DNA編碼細胞色素C氧化酶基因突變與其編碼蛋白結構與功能關系的研究[J]. 中國現代醫學雜志,2004，14(1):60-63,68.

[6] 李娜,高俊巖,劉敏.細胞凋亡和腫瘤的關系研究進展[J]. 當代醫學,2009,15(16):13-14.

[7] Barros MH, Netto LE, Kowaltowski AJ. H2O2generation in Saccharomyces cerevisiae respiratory pet mutants: effect of cytochrome c[J]. Free Radic Biol Med,2003,35(2):179-188.