人體口腔微生物組研究最新進展

薛晶 肖麗英 周學東

（口腔疾病研究國家重點實驗室，四川大學，四川 成都 610041）

隨著生命科學研究的不斷發展，人類邁入后基因組時代。人體的健康決定于基因與環境的相互作用，目前大量的研究集中在分析人的基因組成與疾病易感性和藥物敏感性的關系上。但是，在體內發揮作用、影響人們生老病死的不僅有人的基因，還有大量的共生微生物的基因，其遺傳信息的總和稱為微生物組。只有人體基因組與微生物組“和諧一致，協調行動”才能保證人體的健康。因此，在研究基因與人體健康關系時一定不能忽略共生微生物的基因。2007年12月美國《科學》雜志預測：人體共生微生物的研究將可能是國際科學研究在未來取得突破的7個重要領域之一。本文將簡要介紹人體微生物組、人體口腔微生物組以及微生物基因研究新技術的最新進展。

1 人體微生物組

在人體內部或體表活躍著數以萬計的微生物個體，包括細菌、古細菌、真菌和病毒等。這些微生物占人體總身體質量的1%～2%，數量估計是人體細胞和生殖細胞數量的10倍，它們對人體的健康有著至關重要的作用，如幫助消化食物、合成維生素等，而同時還有一些微生物則可能導致疾病。這些生活在人類體內的微生物被稱為微生物群，它們的基因組被定義為微生物組。人體微生物組的概念最先由Lederberg等[1]提出，指的是在人體內或者表面存在的生態群落中共生、共棲和致病的微生物的總稱。如果將人定義為一個微生物和人體細胞的復合體，人類基因的范疇就包括人類基因組和微生物組的組合，人的新陳代謝功能也混合了人和微生物的特性，人類是由細菌和人體細胞共同組成的一個“超生物體”。

目前對健康和疾病狀態下這些細菌、真菌和其他微生物的作用還所知甚少。最近的研究顯示，微生物在疾病方面，如潰瘍、心臟病和肥胖癥等中扮演著重要的角色。為揭示人體健康、疾病狀態與人體微生物組的關系，美國國立衛生研究院（national institutes of health，NIH）于2007年12月19日宣布啟動一項新的基因工程——人體微生物組項目（human microbiome project，HMP）[2]。

作為NIH生物醫學研究路標計劃的一部分，NIH將在未來5年內在HMP上投資1.5億美元。其主要目標之一是闡明微生物組及影響構成微生物分布和進化的因素，以更好地理解人類遺傳及生理多樣性，其結果可能為當代人類進化提供一個新的視角，即：迅速發展的科學技術、人類的生活方式和生物圈發生的變革，是否影響著“微觀進化”，從而影響人類對健康和各種疾病的易感性。通過宏基因組學方法和傳統基因組DNA測序方法的協調應用，HMP將為進一步研究人體相關微生物群落奠定堅實的基礎。

HMP的研究目標是確定個體之間是否有共同的核心人體微生物組的存在，加深對人體微生物組的變化是否與人體健康狀況相關的理解，開發實現上述目標所需要的新技術和生物信息學工具，處理伴隨HMP項目相關的倫理、法律和社會問題。

HMP的實施主要包括以下內容：首先對500種新的參考細菌的基因組進行序列測序，通過合并其他國際資助項目獲得的微生物基因組信息，從而形成涵蓋大約1 000種微生物基因組的數據庫；然后研究人員將對取自于健康志愿者身體5個部位（消化道、口腔、皮膚、鼻腔和女性泌尿生殖道）組織樣本內的微生物群落進行分析；最后將從患有特定疾病的志愿者體內獲得樣本，從而可以將微生物組在人體特定區域的存在及變化情況與特定的疾病建立聯系。

目前人體微生物組仍是一個未知的領域，HMP的最終目的是通過研究獲得的數據、工具和資源更充分地了解其變化在人類健康和疾病中的作用，它的實施將對疾病的預防、診斷及治療產生重大的影響[3-4]。

2 人體口腔微生物組

健康人的口腔包含有超過600種不同的細菌、病毒和真菌等微生物物種，大部分可以相互關聯并形成生物膜，抵抗機械清除力或抗生素治療，但在環境變化或其他口腔情況（如個人口腔衛生質量）變化觸發時它們也可成為致病微生物。大量的臨床研究[5]顯示，口腔微生物群與齲病和牙周病有著密切的關系。隨著人體微生物組項目的開展，對人體口腔微生物組的研究也日漸增多，NIH牙顱頜面研究所（national institute of dental and craniofacial research，NIDCR）于2008年啟動了第一個口腔微生物組綜合數據庫——人體口腔微生物組數據庫（human oral microbiome database，HOMD）。HOMD于2008年3月25日正式對公眾開放，它是由美國波士頓福賽斯研究所和倫敦國王學院的科學家聯手建立的，對口腔細菌的類型、新陳代謝、致病能力等進行了詳細記錄，提供了它們的數千種基因。該數據庫的網站地址為http://www.homd.org。數據庫的詳細資料將口腔細菌的DNA、蛋白質信息和相關論文關聯在一起[6]，方便使用者查詢。

HOMD的目標是提供大約600種人體口腔原核生物物種群落的全面信息。這些微生物物種的44%可培養并已命名；11%可培養但尚未命名；還有45%無法培養，但可用分子生物學研究手段，通過它們的16S rRNA序列來辨認其DNA指紋。16S rRNA序列是科學家們在過去20年中用來識別微生物遺傳信息的獨特指紋。這一序列信息可以使微生物通過一個家族樹來顯示它們的相互關系。對于那些DNA已被測序的微生物，HOMD提供在線工具來查看和分析它們的基因和蛋白質。每個數據庫中的信息類別都是相互關聯的，易于檢索、注釋，并經常更新。HOMD提出了一個對目前未命名物種的命名方案，使菌株、克隆以及從任何實驗室探測得到的數據可以直接鏈接到一個穩定的有名參考微生物實體。HOMD將序列信息與表型、系統發育、臨床和書目信息數據等相關聯。全部和部分口腔細菌的基因組序列已被確定為HOMD項目和人體微生物組項目的一部分，HOMD同時提供可方便查看所有公開口腔細菌基因組的工具[7-8]。

NIDCR Lawrence Tabak博士認為，HOMD的建立填補了尖端研究的需要，口腔微生物組包含極其豐富的數據，HOMD未來將成為科學家查看和檢索口腔微生物群信息、形成新的科學假設和獲得計算發現的重要搜索引擎，并最終開發出更完善的生物治療方法來控制口腔疾病[9]。

除了HOMD外，人們還開展了對正常人口腔唾液微生物組和核心微生物組的研究。Nasidze等[10]學者分別從北美、南美、歐洲、亞洲以及非洲等不同地區提取了120個人的唾液樣本，通過對這些唾液樣本的14 115個16S rRNA基因進行測序和分析，結果識別出了101種已知的細菌類，其中有39種是從未在口腔中發現過的。此外，還至少發現了64種未知的細菌類。這些研究結果提示口腔微生物組因個體的不同在組成上也存在著很大的差異，并且不受任何地區結構的影響。研究旨在建立健康個體唾液細菌的范圍，以期對未來的疾病診斷提供幫助。Zaura等[11]學者利用454焦磷酸測序技術檢測了3名正常高加索人口腔內5個部位的微生物組。結果發現，在正常人口腔中有3 600種獨特序列，超過500種不同的分類單元或“物種級”表型和88～104種高級分類群（屬或更具包容性的類群）。每個單獨的樣品平均藏匿有266種“物種級”表型，頰部樣本多樣性最小，牙齒鄰面樣本多樣性最高。主成分分析結果顯示來源于牙面的樣本占據了所有部位的主要構成。從3個個體微生物組測序結果分析可知，高級分類群、“物種級”表型和獨特序列都有一個較大的重疊，84%的高級分類群，75%的分類單元和65%的獨特序列至少在3個微生物組中的2個存在。這3個個體的總共6 315個獨特序列中有1 660個相同序列，這1 660個相同序列，即“核心微生物組”貢獻了66%的測序內容，重疊的分類單元貢獻了94%的內容，而幾乎所有的內容（99.8%）都屬于共享的高級分類群。研究證實，不同的健康人口腔細菌大部分微生物組是相同的，提示可能存在健康口腔核心微生物組。

如何使口腔微生物組有助于健康和疾病防治吸引了許多細胞生物學家、微生物學家和免疫學家越來越多的興趣，這些研究將明確如何調控微生物群才能使其有助于維持健康，如在齲齒和牙周病中通過干擾微生物的群落動力而發揮預防作用。另一方面，相關研究人員目前也正在探討口腔微生物群和某些全身性疾病之間的聯系。

3 口腔微生物組研究新技術

對口腔微生物組的認識很大程度上依賴于研究手段。根據Staley等[12]的觀點，低于1%的微生物可以在實驗室環境下生長，提示以培養技術為基礎研究口腔微生物菌群的復雜性和基因多態性具有嚴重偏差?，F代生物技術以DNA為基礎的一系列研究方法，如16S rRNA基因技術、高通量指紋技術、宏基因組學技術以及下一代測序技術，使人類可以在結構復雜性和基因多態性的意義下更清晰地研究和了解人體微生物菌群[13]。

3.1 16S rRNA基因測序技術

1985年開始應用的PCR技術開啟了對以前未知微生物群落的非培養依賴性分析和鑒別，包括口腔生物膜中的常駐微生物。Woese[14]發現，16SrRNA構成了原核細菌核糖體亞基的一個保守序列。所有物種的16S rRNA序列的部分區域是高度保守的，而其他區域則變化較大。保守的區域，可從基因組DNA序列擴增16S rRNA序列，而多變的區域則經常根據系統發育用于生物分類。因此，16SrRNA序列對基因組研究特別有用，可以幫助確定在一個給定的樣本中有哪些生物分類群的存在以及它們的豐度如何。編碼16S rRNA基因順序的保守性和多樣性使從種屬水平構建細菌進化樹關系成為可能。16S rRNA序列可從2個方面獲得：通過宏基因組DNA樣本使用不同的引物專門地擴增獲得，也可通過宏基因組DNA序列的傳統全基因組鳥槍法測序隨機獲得。一般來說，第2種方法獲得的16S rRNA序列會減少，但同時消除了PCR反應的誤差。

3.2 高通量指紋技術

采用高通量指紋技術檢測環境微生物群落，可以直接檢測從微生物群落樣本中提取的核酸，以PCR為基礎，如變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gelelectrophoresis,DGGE）[15]，溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）[16]，末端限制性酶切片段長度多態性（terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）[17-18]。這些技術已經被學者廣泛地用來研究人體口腔微生物的種屬。

DGGE/TGGE是一種以PCR為基礎的微生物群落分析方法，將特定微生物群落DNA庫中的標記基因進行PCR擴增。PCR混合產物進行DGGE/TGGE，不同順序成分的DNA在不同變性濃度下變性，表現出凝膠上的不同條帶，形成不同的條帶模式，理論上認為一個條帶就代表菌落中的一種不同種屬的細菌。實驗所獲得的指紋圖譜反應了群落的結構，包括其復雜性以及每一個被檢測種屬的相對含量。將凝膠上的條帶進行回收、克隆及測序，便可鑒定對應微生物的種屬。

T-RFLP是廣泛應用于環境微生物群落的評價及不同生態系統復雜性和基因多態性比較的替代性分子學技術，也是以PCR為基礎，對一定的目標基因進行PCR擴增，使用熒光標記的引物，得到有熒光標志的PCR混合產物。由于從不同種屬細菌擴增來的目標基因可能在不同的位置含有不同數量的限制性內切酶片段，用特定的內切酶水解PCR產物，就會產生不同反應的被測微生物群落特征的條帶模式，或“指紋”。由于末端限制性酶切片段長度可由已知的16S rRNA或其他目標基因序列預知，因此建立數據庫相對較容易，每次T-RFLP所測的結果可以通過將結果峰與已有數據庫進行比較而進行便捷的闡釋。

指紋技術較16S rRNA基因測序技術雖然可對整個微生物群落進行分析，獲得微生物組的情況，然而，不同指紋技術的研究結果很難進行比較，并且不能檢測微生物的分類和功能[13]。

3.3 宏基因組學技術

“宏基因組”是由Handelsman等[19]1998年提出的，包含了比可培養微生物大得多的遺傳信息，其定義是生物環境中全部微小生物遺傳物質的總和。宏基因組目前主要是指環境樣品中細菌和真菌的基因組總和，其文庫既包括了可培養的和未培養的微生物遺傳信息，因此提供了獲得新生物活性物質的機會。宏基因組學的基本方法是分析微生物環境中的基因組組合，直接分離未培養微生物基因組DNA，將其克隆到可培養的微生物中，最后篩選出所需的。

3.4 焦磷酸測序技術

焦磷酸測序技術是近年來發展起來的一種新的下一代序列分析技術，它通過核苷酸和模板結合后釋放的焦磷酸引發酶級聯反應，促使熒光素發光并進行檢測，是一個理想的遺傳分析技術平臺，既可進行序列分析，又可進行基于序列分析的單核苷酸多態性檢測及等位基因頻率測定等[20]。焦磷酸測序技術的建立與應用使得高通量準確測定特征序列、有效進行微生物的分型鑒定成為可能。

焦磷酸測序技術的核心是由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯化學發光反應，這4種酶分別為：DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶，反應底物為5′-磷酰硫酸、熒光素，反應體系還包括待測序DNA單鏈和測序引物。在每一輪測序反應中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數的焦磷酸基團。焦磷酸基團可最終轉化為可見光信號，并由焦磷酸測序儀器轉化為一個峰值，每個峰值的高度與反應中摻入的核苷酸數目是成正比的。然后加入下一種dNTP，繼續DNA鏈的合成。每一個dNTP的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯起來，以熒光信號的形式實時記錄模板DNA的核苷酸序列。

4 結語

人類口腔微生物與人體始終處于動態生態平衡狀態，為維護人體的健康發揮重要的作用，也與多種口腔疾病的發生發展有密切關系，因此，對這些微生物的基因進行全面測序和對它們的生理功能進行深入解析，可為各類疾病的預防和治療帶來全新的思路和方法。人類口腔微生物組數據庫的建立為人們了解、認知復雜的口腔微生物環境提供了一個嶄新的平臺，為各種口腔疾病的預防和治療奠定了基礎。

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