轉腫瘤壞死因子-α基因的腫瘤引流淋巴結細胞對人舌鱗癌SCID鼠移植瘤的生長抑制作用

孟箭 郭偉 張志愿 任國新 竺涵光 何悅 周曉健

（1.東南大學醫學院附屬徐州市中心醫院 口腔科，江蘇 徐州 221009；2.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院 口腔頜面外科，上海 200011）

腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）基因轉導腫瘤引流淋巴結細胞（drainage node of lymphocytes，DNL）后發現其外緣性基因能夠表達，分泌高活性的TNF，在體外具有強大的抗腫瘤活性[1]。TNF-α基因轉導的舌鱗癌DNL瘤周注射比靜脈輸注到達瘤體的濃度高[2-3]。但體內是一個復雜的環境，體內抑瘤效果尚不清楚。本實驗在建立人舌鱗癌SCID鼠移植瘤模型的基礎上，觀察局部應用TNF-α基因轉導的DNL以及聯合應用低劑量平陽星（Pinyancin，PYC）對人舌鱗癌的抑瘤效果，并對其機制進行探討，以期為臨床免疫化療提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取由上海市腫瘤研究所動物房提供的SCID鼠15只，4～6周齡，體重18～24 g，在SPF條件下飼養。

1.2 制備舌鱗癌TNF/DNL

制備舌鱗癌TNF/DNL的方法見參考文獻[1]。

1.3 荷瘤SCID鼠模型的建立

人舌鱗癌Tca8113細胞株（上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院口腔頜面外科）解凍復蘇，37℃、5%CO2條件下于含10%小牛血清的RPMI1640培養基中培養。取對數生長期貼壁生長的細胞，經0.25%胰蛋白酶消化后，用PBS緩沖液洗滌3次，計數后配成濃度為每升1×1010個的腫瘤細胞懸液，給SCID鼠皮下注射0.2 mL。

1.4 實驗分組

將15只實驗動物隨機分為3組，即對照組、TNF/DNL加重組白細胞介素-2（recombinant interleukin-2，rIL-2）組和TNF/DNL加rIL-2加PYC組，每組5只。對照組在SCID鼠皮下注射等量生理鹽水。TNF/DNL加rIL-2組：在腫瘤接種12 h后于腫瘤部位注射濃度為每升5×1010個的TNF/DNL 0.2 mL，腹腔注射1×104U·mL-1rIL-2 0.2 mL。TNF/DNL加rIL-2加PYC組：腫瘤接種12 h后腹腔注射0.5 g·L-1的PYC 0.2 mL，12 h后接種部位注射濃度為每升5×1010個的TNF/DNL 0.2 mL，腹腔注射1×104U·mL-1rIL-2 0.2 mL。

1.5 移植瘤生長情況及抑瘤作用評價

荷瘤SCID鼠飼養在SPF環境中，每周觀測瘤體大小，第8周測量體積后處死，解剖稱重，按下列公式計算抑瘤率：抑瘤率（%）=（1-實驗組平均瘤重/對照組平均瘤重）×100%。

1.6 細胞凋亡超微結構的觀察

1.6.1 電鏡檢查 TNF/DNL加rIL-2組移植瘤在4℃條件下將標本置于3%戊二醛固定液中浸泡24 h，用0.1 mol·L-1二甲砷酸鈉緩沖液漂洗72 h后用1%四氧化鋨固定2 h，乙醇逐級脫水后用環氧樹脂618定向包埋，切0.5 μm的中薄切片，甲苯胺藍染色后作光鏡定位觀察，根據光鏡定位制備70 μm超薄切片，經醋酸雙氧鋰及檸檬酸鉛雙重電子染色后，用Hitachi-600透射電鏡觀察。

1.6.2 TUNEL法凋亡細胞原位標記 切片常規脫蠟至水，室溫下20 mg·L-1蛋白酶K消化25 min；置0.3%H2O2甲醇溶液處理1 h；0.1%TritonX-100溶液4 ℃ 2 min；加5 μL平衡液和45 μL含TDT酶的反應液共50 μL（TUNEL試劑盒）37℃反應1 h；滴加抗生素堿性磷酸酶抗體置于濕盒中37℃孵育30 min；DAB顯色，蘇木蘇復染，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，封蠟。未加脫氧核糖轉移酶TdT的dUTP作陰性對照。結果判定標準：細胞核深棕褐色者為凋亡陽性細胞，計算凋亡細胞占總計數的百分比為凋亡指數（apoptosis index，AI）, 每份標本于40×10視野下隨機檢測10個視野。

1.7 統計學處理

采用SAS 10.0軟件包對每組的抑瘤率作兩兩比較；各組的AI用±s表示，對組間均數進行t檢驗比較組間差異。統計的顯著性水平設定為α=0.05。

2 結果

2.1 各組腫瘤的生長情況

對照組接種后第2周移植瘤體積開始增大，第3周體積增大迅速，第8周平均體積已達3.771 cm3；TNF/DNL加rIL-2組、TNF/DNL加rIL-2加PYC組接種后腫瘤體積增長緩慢，第8周時二者瘤體平均體積分別為1.422、0.334 cm3。對照組、TNF/DNL加rIL-2組和TNF/DNL加rIL-2加PYC組腫瘤重量分別為（2.988±0.454）、（1.086±0.407）、（0.272±0.097）g。第8周末TNF/DNL加rIL-2組和TNF/DNL加rIL-2加PYC組抑瘤率分別為63.65%、90.90%，二者間差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 電鏡觀察結果

TNF/DNL加rIL-2組看到典型的凋亡細胞，表現為胞核染色質固縮，聚集在核的邊緣，呈半球狀，也可均勻平鋪于核膜下形成半月狀或塊狀，并可見凋亡小體，細胞漿內各種細胞器基本正常（圖1、2）。

圖 1 TNF/DNL加rIL-2組凋亡細胞胞核染色質固縮，呈塊狀TEM ×4 800Fig 1 Apoptotic chromatin condensation nuclei into a block in the TNF/DNL and rIL-2 group TEM ×4 800

圖 2 TNF/DNL加rIL-2組凋亡細胞胞核染色質固縮，并可見凋亡小體 TEM ×3 810Fig 2 Apoptotic chromatin condensation nuclei with apoptotic bodies in the TNF/DNL and rIL-2 group TEM ×3810

2.3 TUNEL法檢測結果

TNF/DNL加rIL-2組和對照組的AI（每100個細胞中）分別為（10.06±2.62）、（3.26±1.51）個。TNF/DNL加rIL-2組與對照組相比，細胞核內有明顯的標記物出現，AI明顯升高，與對照組間差異有統計學意義（P＜0.05）（圖3～5）。

圖 3 對照組鱗癌組織中有散在的凋亡細胞，胞核染色質固縮積聚在核的邊緣，呈半球狀 TUNEL ×200Fig 3 Squamous cell carcinoma with scattered apoptotic cells in control group,and chromatin condensation nuclei in the nuclear accumulation of the edge into a hemispherical shape TUNEL ×200

圖 4 TNF/DNL加rIL-2組凋亡細胞數量較多 TUNEL ×200Fig 4 More apoptotic cells in the TNF/DNL and rIL-2 group TUNEL ×200

圖 5 TNF/DNL加rIL-2組凋亡細胞胞體縮小，細胞核深重褐色TUNEL ×400Fig 5 Bodies of apoptotic cells shrinked and nucleus were deep brown in the TNF/DNL and rIL-2 group TUNEL ×400

3 討論

近年來，由于腫瘤免疫學、分子生物學和基因工程的飛速發展，免疫效應細胞和細胞因子在腫瘤治療中的作用越來越顯示出其重要性[4-6]。其中，TNF是目前抗腫瘤作用較肯定的細胞因子[5]。TNF具有多種免疫生物活性和很強的抗腫瘤作用，但人體因無法耐受常規治療劑量的TNF而限制其臨床應用，利用細胞因子轉基因手段可將TNF基因通過TIL細胞的運載而達到腫瘤局部產生高濃度TNF因子，不僅可以解決機體耐受性問題，而且可顯著提高療效。Rosenberg[7]從1例惡性黑色素瘤的患者中分離出TIL，利用逆轉錄病毒載體轉染TNF基因，然后回輸給患者，這些TIL細胞可以聚集在腫瘤區域，產生TNF，對惡性黑色素瘤有一定的治療作用。白細胞介素-2激活的DNL細胞已被證實與腫瘤浸潤淋巴細胞具有相似的抗瘤效應[8]。動物實驗表明，口腔癌DNL與低劑量的平陽霉素聯合應用可增強其抗腫瘤作用[9]。TNF-α基因轉導的DNL比未轉導組在體外具有更強大的殺瘤活性，研究結果提示TNF-α基因轉導的DNL局部注射比靜脈輸注到達瘤體的濃度高?；诖?，本實驗采用腫瘤接種部位注射TNF/DNL，取得了較好的體內抑瘤效果；腹腔應用低劑量的平陽星，12 h后局部應用TNF/DNL抑瘤效果更顯著。本實驗說明，TNF/DNL與平陽星聯合應用在動物體內能夠有效抑制舌鱗癌生長，提示TNF/DNL和平陽星聯合應用可以對微小的腫瘤灶或殘留腫瘤起到有效的殺傷作用。

本實驗表明，TNF/DNL與低劑量的平陽星聯合應用抗腫瘤作用增強，其主要機制可能是：平陽星為細胞周期非特異性藥物，對機體的免疫功能和造血功能無明顯影響，抗癌作用較強，不良反應小。平陽星直接作用于瘤體，殺傷腫瘤細胞，減輕腫瘤負荷，使過繼免疫基因治療對較小腫瘤發揮有效的抗瘤作用?；熕幬锊粌H對腫瘤細胞殺傷，還可能對免疫效應細胞產生殺傷，影響療效。平陽星經靜脈注射半衰期為6～12 h，腹腔應用低劑量的平陽星，12 h后注射TNF/DNL，則平陽星對TNF/DNL的活性較少抑制。提示臨床可以采用序貫給藥，即先通過腫瘤敏感性化療藥物大量殺傷腫瘤細胞，然后應用免疫基因治療消滅殘存的癌細胞，加強其抑瘤效果。另一方面，某些化療藥物可使免疫效應細胞聚集到腫瘤部位，其機制可能是化療藥物對腫瘤細胞表面抗原進行修飾，使LAK細胞容易攻擊[10]。

實驗證明[5，8，11]口腔癌DNL細胞可以誘發Tca8113細胞凋亡，而且TNF本身可以直接殺傷腫瘤細胞，也可誘導腫瘤細胞凋亡。從細胞凋亡角度來分析TNF/DNL的治療作用，對進一步揭示其作用機制，提高療效具有重要意義。透射電鏡觀察顯示，TNF/DNL加rIL-2組腫瘤細胞有典型的凋亡細胞出現，其特征是細胞核體積縮小，染色質濃縮致密，并沿核膜分布形成新月體狀和塊狀，細胞膜微絨毛消失，但細胞漿內的各種細胞器基本正常，也可見較多的腫瘤細胞壞死。而且，TUNEL法檢測結果顯示TNF/DNL加rIL-2組細胞核內有明顯的標記產物出現。TNF/DNL組比對照組AI增高（P＜0.05），說明除了通過直接殺傷和介導免疫反應致腫瘤細胞壞死外，誘導腫瘤細胞凋亡可能是TNF/DNL抗腫瘤作用的重要機制之一，但其中的調節機制尚需進一步研究。

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