過表達外源性Notch1對舌鱗癌細胞體外生長及表皮生長因子受體表達的影響

黃紅杰 平飛云 胡濟安 趙士芳

（1.杭州師范大學附屬醫院 口腔科，浙江 杭州 310015；2.浙江大學附屬第二醫院 口腔科，浙江 杭州 310008；3.浙江大學附屬口腔醫院 口腔病理科；4.口腔頜面外科，浙江 杭州 310006）

Notch信號途徑的主要受體為Notch1，其是否具有促癌或抑癌作用取決于腫瘤的組織來源和細胞類型[1-2]，在舌癌中的作用尚未明確。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）在舌癌等多種上皮性腫瘤中過表達，具有促癌作用[3-4]。近年來的研究[5-7]表明，Notch1和EGFR信號途徑在許多腫瘤中存在交互作用，共同調控細胞增殖和分化。本課題組在以前的實驗中檢測了舌癌標本中Notch1和EGFR的表達，推測Notch1在舌癌中起抑癌作用并與EGFR可能存在交互作用。本實驗將在人舌鱗癌Tca8113細胞中進一步探討過表達外源性Notch1對細胞體外生長和EGFR表達的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

PRMI1640培養基、TRIzol溶液（Gibco公司，美國），脂質體LipofectamineTM2000（Invitrogen公司，美國），甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）（Sigma公司，美國），Taq DNA聚合酶、逆轉錄酶M-MLV（Promega公司，美國），一抗Notch1（sc-6014）、EGFR（sc-03）、β-actin（sc-47778）（Santa Cruz公司，美國），ECL試劑盒（Pierce公司，美國），SP免疫細胞化學試劑盒（北京中杉公司）。

1.2 細胞培養

Tca8113細胞購自中國科學院上海細胞生物研究所，用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基在含5%CO2的37°C恒溫培養箱中常規傳代培養。

1.3 體外基因轉染

編碼Notch1胞內域的真核表達質粒pRAMICIRES2-EGFP和對照質粒pIRES2-EGFP由第四軍醫大學基礎醫學院醫學遺傳和發育系張萍惠贈。采用LipofectamineTM2000進行體外基因轉染，按產品說明書操作。實驗分3組：目的質粒轉染組、對照質粒轉染組和未轉染組。細胞培養于6孔板中，轉染日細胞密度為80%～90%。以OPTI-MEMⅠ無血清培養基分別稀釋質粒和脂質體，室溫孵育5 min后，將上述2組分輕緩混合，室溫下孵育20 min,將混合液加入細胞中，37°C下繼續培養。轉染8 h后開始用熒光倒置顯微鏡觀察并計算轉染效率。在高倍鏡下隨機選擇5個視野計數細胞，按發生綠色熒光的細胞數占細胞總數的百分比評估轉染效率。轉染48 h后收集每組細胞，用RT-PCR和Western blot分別檢測Notch1和EGFR的mRNA和蛋白的相對水平。

1.4 MTT法檢測細胞增殖

取對數生長期Tca8113細胞接種于96孔板中，每孔100 μL（細胞密度為每孔2.5×104個），37 ℃、5%CO2培養箱孵育，過夜后分別用上述方法轉染目的質粒和對照質粒，未轉染細胞作為陰性對照，完全培養基作為空白對照。分別于轉染后1～4 d每天采用MTT法檢測細胞增殖活性，每一時間點設3個復孔。每孔加入10 mg·mL-1MTT溶液10 μL，37 ℃、5%CO2飽和濕度下孵育4 h，吸棄孔內培養液，加入二甲基亞砜150 μL，室溫振蕩10 min。酶標儀檢測490 nm處光密度值。以時間為橫坐標、光密度值為縱坐標繪制細胞增殖曲線。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

轉染48 h后，收集目的質粒轉染組、對照質粒轉染組和未轉染組細胞，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH=7.4）洗1次。用70%冰乙醇1 mL于-20℃下固定過夜。上機前離心，棄乙醇，PBS洗2次。加RNase A（終濃度為0.05 g·L-1）10 μL、碘化丙啶250 μL（終濃度為25 μg·mL-1）、PBS 240 μL，混合后室溫避光染色0.5 h。流式細胞儀（BD公司，美國）檢測細胞凋亡。

1.6 RT-PCR檢測

轉染48 h后，分別用TRIzol試劑提取目的質粒轉染組、對照質粒轉染組和未轉染組細胞總RNA，總RNA濃度和純度用紫外分光光度計測定。各取2 μg總RNA，用M-MLV進行逆轉錄，再取等體積cDNA模板進行RCR擴增，β-actin作為內參照。反應條件：預變性94℃ 3 min，變性94℃ 40 s、退火55℃30 s、延伸72℃ 60 s，共30個循環，經72℃ 5 min，至4℃。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠作電泳，用凝膠電泳顯像系統（Bio-Rad Laboratories公司，美國）分析。PCR引物見表1。

表 1 目的基因PCR引物序列及擴增長度Tab 1 List of primers used for RT-PCR with corresponding amplicon sizes

1.7 Western blot檢測

轉染48 h后，分別用三去污劑法提取目的質粒轉染組、對照質粒轉染組和未轉染組細胞總蛋白，用Bradford法測定蛋白濃度，各取50 μg蛋白上樣。其操作步驟簡述如下：蛋白經SDS-PAGE 60 V電泳1.5 h后轉移至聚偏氟乙烯膜，5%脫脂奶粉37℃下封閉1 h，一抗4℃過夜，相應二抗（1∶3 000）37℃孵育1 h，ECL試劑盒化學發光后曝光成像。一抗Notch1、EGFR的工作濃度為1∶200。β-actin（1∶500）作為內參。用BandScan5.0軟件進行灰度掃描分析蛋白相對水平。

1.8 免疫細胞化學檢測

細胞接種前在6孔板底鋪蓋玻片，按上述方法培養細胞并基因轉染。于轉染48 h后吸去液體，PBS輕洗、吸干；用4℃純丙酮固定5 min，PBS輕洗5 min×3、吸干。按SP法免疫細胞化學試劑盒操作步驟進行。鼠抗人EGFR單克隆抗體工作濃度為1∶100。用PBS代替一抗作為陰性對照。陽性標準為光鏡下細胞膜及細胞質有棕黃色顆粒狀染色，背景清晰；反之，細胞膜及細胞質無棕黃色顆粒染色，則為陰性標準。

1.9 統計學處理

應用SPSS 12.0軟件進行統計學分析，組間差異比較用t檢驗和方差分析，Р＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基因轉染結果

質粒轉染Tca8113細胞8 h后，在熒光倒置顯微鏡下可觀察到少量綠色熒光表達細胞，24 h后表達量明顯增加，48 h后達到高峰。轉染24 h后，目的質粒pRAMIC-IRES2-EGFP和對照質粒pIRES2-EGFP的轉染效率分別為69.8%和67.3%（圖1）。

圖 1 Tca8113細胞質粒轉染24 h后轉染效率 熒光倒置顯微鏡×400Fig 1 Transfection rates of the plasmids in Tca8113 cells fluorescent inverted microscope ×400

2.2 基因轉染后Tca8113細胞增殖的變化

瞬時轉染編碼Notch1胞內域的表達質粒后，Tca8113細胞增殖受到明顯抑制（Р＜0.05），對照質粒轉染后則無明顯抑制效應（Р＞0.05）（圖2）。

2.3 基因轉染后Tca8113細胞凋亡率的變化

轉染48 h后，流式細胞儀檢測顯示，目的質粒轉染組、對照質粒轉染組、未轉染組的細胞凋亡率分 別 為 19.51% ±4.12% 、 2.63% ±0.78% 、 2.55% ±0.69%。與對照質粒轉染組和未轉染組相比，目的質粒轉染組的細胞凋亡率增高（P＜0.05），對照質粒轉染組與未轉染組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖 2 MTT法檢測Tca8113細胞增殖Fig 2 The cell proliferation of Tca8113 cells evaluated by MTT assay

2.4 基因轉染后Tca8113細胞Notch1和EGFR表達的變化

瞬時轉染48 h后，目的質粒轉染組、對照質粒轉染組和未轉染組細胞的Notch1的mRNA和蛋白的相對水平分別為1.102±0.135和0.976±0.103、0.243±0.032 和 0.136 ±0.028、 0.265 ±0.039 和 0.138 ±0.029，EGFR的mRNA和蛋白的相對水平分別為0.083±0.009和0.079±0.008、0.605±0.075和0.554±0.067、0.915±0.115和0.813±0.091（均以β-actin作為內參）。質粒轉染后48 h，RT-PCR檢測Tca8113細胞的Notch1和EGFR的mRNA表達見圖3、4。

圖 3 質粒轉染后48 h，RT-PCR檢測Tca8113細胞的Notch1和EGFR的mRNA表達Fig 3 The mRNA levels of Notch1 and EGFR in Tca8113 cells were detected by RT-PCR

圖 4 質粒轉染后48 h，Western blot檢測Tca8113細胞的Notch1和EGFR的蛋白表達Fig 4 The protein levels of Notch1 and EGFR in Tca8113 cells were detected by Western blot

與未轉染組相比，目的質粒轉染組的Notch1的mRNA和蛋白分別上調3.2倍和6.1倍，EGFR的mRNA和蛋白則下調10.0倍和9.3倍。目的質粒轉染組與對照質粒轉染組和未轉染組相比，Notch1的mRNA和蛋白的表達上調（Р＜0.05），而EGFR的mRNA和蛋白的表達下調（Р＜0.05）；對照質粒轉染組與未轉染組相比，Notch1的mRNA和蛋白的表達差異無統計學意義（Р＞0.05），EGFR mRNA和蛋白的表達稍有下調，但差異無統計學意義（Р＞0.05）（圖3、4）。

2.5 基因轉染后Tca8113細胞EGFR蛋白表達的變化

Tca8113細胞在轉染編碼Notch1胞內域的表達質粒48h后，與對照質粒轉染組和未轉染組相比，EGFR蛋白的陽性表達率下降，染色強度明顯降低，而對照質粒轉染后對Tca8113細胞EGFR蛋白表達無明顯影響（圖5）。

圖 5 質粒轉染48 h后，Tca8113細胞EGFR蛋白的表達 SP ×400Fig 5 The expression of EGFR protein in Tca8113 cells was detected by immunocytochemistry SP ×400

3 討論

Notch信號途徑通過相鄰細胞膜上的受體-配體間相互作用而被激活，在哺乳動物細胞增殖、分化和凋亡等命運決定中起關鍵作用，其異常調控可引起腫瘤等多種疾病的發生[8-10]?，F已明確，Notch信號途徑的主要受體Notch1在大多數組織中維持細胞未分化或保持干細胞狀態、促進細胞增殖[8-10]，但在皮膚等組織中Notch1誘導細胞分化[11-12]。Notch1在許多腫瘤中存在異常表達。在人低分化乳腺癌[13]和急性T淋巴細胞白血病[13]中，Notch1過表達起促癌作用。在皮膚癌[11-12]和晚期宮頸癌[13]中，Notch1表達下調起抑癌作用。舌癌是最常見的口腔癌，起源于舌黏膜上皮基底層中部分角質形成細胞。本課題組在以前的實驗中通過免疫組化首次檢測了正常舌黏膜和舌鱗癌標本中Notch1的表達。在正常舌黏膜中，Notch1的陽性表達主要位于角化層及部分顆粒層和棘層細胞，基底層細胞無表達。這一結果與Notch1在皮膚中的表達相似，提示Notch1在正常舌黏膜中誘導細胞分化。在舌鱗癌標本中，Notch1主要表達于癌巢中鱗狀化生的角化細胞及類棘層細胞，癌巢周邊細胞則無Notch1表達。這一結果與Notch1在皮膚癌[11-12]和宮頸癌[13]中的表達相似。本實驗中，通過基因轉染上調Tca8113細胞Notch1的表達，抑制細胞增殖，并誘導細胞凋亡。這一結果與Duan等[14]報道的一致。上述結果提示，Notch1在舌鱗癌中可能起抑癌作用，外源性過表達Notch1抑制舌鱗癌細胞生長。

Notch1抑癌作用的分子機制尚未明確，抗細胞增殖效應和誘導細胞凋亡作用可能是其中的重要機制。研究[13]發現，外源性過表達Notch1在小細胞肺癌和肝癌細胞系中引起細胞p21waf1/Cip1和p27kip1的上調，導致G0/G1細胞周期停止，抑制細胞增殖，且在肝癌細胞系中引起細胞p53的明顯上調而誘導細胞凋亡，在皮膚癌[11-12]中則下調β-連環蛋白的表達而抑制細胞增殖。Duan等[14]同樣發現，外源性過表達Notch1可能通過下調Wnt/β-catenin信號而抑制舌鱗癌細胞體外增殖并誘導其凋亡。

Notch1和EGFR信號通路在不同腫瘤中存在相互協同或拮抗的交互作用[5-7]，共同調控細胞增殖和分化。本課題組在以前的實驗中發現，EGFR在舌鱗癌標本中的表達與Notch1的明顯不同，EGFR表達的部位，Notch1失表達，反之亦然。本實驗首次發現，Tca8113細胞在瞬時轉染編碼Notch1胞內域的表達載體后，在上調Notch1的同時，明顯下調EGFR表達。上述結果提示，Notch1和EGFR信號途徑可能在舌鱗癌中存在交互拮抗作用，共同調控細胞增殖和分化。EGFR信號途徑維持正常皮膚和黏膜細胞的未分化狀態，在皮膚癌和舌癌中持續激活，促進細胞增殖，起促癌作用[3-4，15]。而Notch1在皮膚和黏膜中促進細胞分化，在皮膚癌和舌癌中下調而起抑癌作用。因此，舌鱗癌標本及Tca8113細胞中Notch1的下調和EGFR的上調，可能與促進癌細胞增殖有關，而在鱗狀化生部分Notch1的上調和EGFR的下調，可能是癌細胞分化的標志。

Notch1和EGFR交互作用的內在機制目前仍不清楚。最新研究表明，p53可能介導二者的交互作用。在神經膠質瘤細胞中，Notch1和EGFR均過表達，p53作為EGFR啟動子的激活子介導Notch1對EGFR的正向調控，抑制Notch1的表達，則下調p53表達，同時下調EGFR的表達，而外源性過表達Notch1，則上調p53表達，同時上調EGFR的表達，二者相互協同促進細胞增殖[7]。在皮膚癌細胞中，Notch1和EGFR相互拮抗，EGFR信號通路通過下調p53基因的轉錄而負向調節其靶基因Notch1的表達，抑制細胞分化，維持增殖狀態[6]。舌癌與皮膚癌一樣均屬于角質形成細胞來源的腫瘤，p53是否介導舌鱗癌細胞中EGFR對Notch1的負向調節目前仍不清楚。但本實驗發現，舌鱗癌細胞中存在Notch1對EGFR的負向調節，p53是否參與其中值得進一步探討。

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