產葡萄糖氧化酶黑曲霉的誘變選育及葡萄糖酸鈣發酵條件的研究

梁靜娟，李筱瑜，官 威，龐宗文，麥志茂

（廣西大學生命科學與技術學院，廣西南寧530005）

產葡萄糖氧化酶黑曲霉的誘變選育及葡萄糖酸鈣發酵條件的研究

梁靜娟，李筱瑜，官 威，龐宗文，麥志茂

（廣西大學生命科學與技術學院，廣西南寧530005）

用紫外線和鈷60放射線照射對產葡萄糖氧化酶的黑曲霉菌株P-9進行誘變，以含有2-脫氧-D-葡萄糖的選擇培養基進行篩選，共獲得7個耐受菌株，其中產酶活性最大的U-69菌株的葡萄糖氧化酶活力是出發菌株P-9的2.5倍。研究了U-69菌株合成葡萄糖酸鈣的發酵條件，結果顯示，最佳發酵條件為葡萄糖150g/L，碳酸鈣400g/L，硫酸銨3～4g/L，pH 5.5，250mL三角瓶裝30mL發酵液，接種量10%，30～34℃發酵18h。

黑曲霉，葡萄糖氧化酶，誘變，葡萄糖酸鈣

葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，簡稱GOD）能專一地將β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和過氧化氫［1］，在食品、醫藥及生物等領域有著廣泛的應用。葡萄糖酸與CaCO3等鈣鹽反應可生成葡萄糖酸鈣，葡萄糖酸鈣有助于骨質形成，能促進骨骼和牙齒的發育，用于預防和治療缺鈣癥等。葡萄糖酸鈣的生產主要采用黑曲霉發酵法，提高黑曲霉產葡萄糖氧化酶的能力是實現高產葡萄糖酸鈣的最有效的手段。本研究通過紫外和放射誘變來獲得葡萄糖氧化酶高產菌株，對高產菌株合成葡萄糖酸鈣條件進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黑曲霉P-9 由本課題組篩選并保存；篩選培養基［2］（g/L） 葡萄糖80、蛋白胨3、（NH4）2HPO40.39、KH2PO40.19、Mg2SO4·7H2O 0.16、CaCO33.5、可溶性淀粉10、KI 1.7、脫氧膽酸鈉0.2、瓊脂20、磷酸緩沖液0.1mol/L，pH5.6；選擇培養基 添加有1.5g/L的2-脫氧-D-葡萄糖的麥芽汁瓊脂；發酵培養基［2］（g/L）葡萄糖 80、蛋白胨 3、（NH4）2PO40.388、KH2PO40.188、Mg2SO4·7H2O 0.156、CaCO335，pH自然。

1.2 實驗方法

1.2.1 誘變方法

1.2.1.1 紫外線誘變 取黑曲霉P-9的孢子，用無菌生理鹽水制成108個/mL的孢子懸液。取2mL孢子懸液于無菌培養皿中，鋪成一層薄層，于暗室內30W紫外燈下20cm處照射8min。取照射液進行適當稀釋，涂布于選擇培養基，用黑紙包裹，30℃恒溫避光培養4d，待長出孢子后，將孢子點種于篩選培養基，挑選在菌落周圍出現較大藍色圈的菌株，分別進行發酵并測定葡萄糖氧化酶活力。

1.2.1.2 鈷60放射誘變 取黑曲霉P-9的孢子，用無菌生理鹽水制成108個/mL的孢子懸液。孢子懸液于鈷60源下照射，照射劑量為1.2kGy。取處理液進行適當稀釋，涂布選擇培養基，30℃恒溫培養4d，待長出孢子后，將孢子點種于篩選培養基，挑選在菌落周圍出現較大藍色圈的菌株，分別進行發酵并測定葡萄糖氧化酶活力。

1.2.2 葡萄糖氧化酶的制備 將黑曲霉孢子用無菌水制成2.0×109個孢子/mL左右的孢子懸浮液，于發酵培養基中接入10%（v/v）的孢子懸浮液，30℃，200r/min下發酵培養18h后，離心收集菌絲體，菌絲體反復用0.1mol/L，pH 5.0磷酸緩沖液沖洗，置于-20℃冰箱中冰凍后，研磨，離心取上清液即為葡萄糖氧化酶粗酶液。

1.2.3 產葡萄糖酸鈣黑曲霉發酵條件的研究 選擇影響葡萄糖酸鈣發酵產量的發酵溫度、pH、裝液量、孢子接種量、葡萄糖濃度、碳酸鈣用量等進行研究。改變一種發酵條件，其他條件不變，發酵后測定葡萄糖酸鈣含量，得出單因素最佳水平。

1.2.4 葡萄糖氧化酶酶活力的測定 本研究采用分光光度計分析法測定葡萄糖氧化酶活性［4］。反應混合液含2mL 1mol/L葡萄糖（用0.1mol/L的檸檬酸鈉-磷酸緩沖液配制，pH 5.0），1mL 0.1% 苯醌（benzoquinone）和100μL粗酶液，反應液于35℃下保溫反應 10min，于 290nm處測定形成的氫醌（hydroquinone）量。葡萄糖氧化酶的單位（U）定義為35℃，pH 5.0下每克菌體每分鐘產生1μmol氫醌的酶量。

1.2.5 葡萄糖酸鈣的測定 采用鈣紅指示劑法［3］。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖氧化酶產生菌的誘變選育

黑曲霉P-9經過紫外線照射處理，共獲得5個耐受2-脫氧-D-葡萄糖的突變菌株，分別是U-15、U-17、U-56、U-69和U-78。經過鈷60誘變處理共獲得2個耐受2-脫氧-D-葡萄糖的菌株，分別是G-206和G-235。7個耐2-脫氧-D-葡萄糖突變株經藍圈篩選和發酵測定，有4個菌株的葡萄糖氧化酶產量高于出發菌株，產酶水平最高的是U-69菌株，為28.7U/g，是出發菌株P-9的2.5倍，結果見表1。

表1 經過紫外線誘變和鈷60誘變所獲得的突變菌株的葡萄糖氧化酶活性

2.2 葡萄糖酸鈣發酵條件優化

選擇葡萄糖氧化酶活力最高的突變株U-69，研究其發酵生產葡萄糖酸鈣的發酵條件。

2.2.1 葡萄糖濃度對葡萄糖酸鈣產量的影響 葡萄糖是合成葡萄糖酸鈣的主要底物，應有足夠量方可使葡萄糖酸鈣達到一定產量。圖1是不同葡萄糖濃度下葡萄糖酸鈣的產量，從圖1可以看出，最適的葡萄糖濃度為150g/L，過多的葡萄糖會抑制葡萄糖酸鈣的形成。

圖1 葡萄糖濃度對U-69菌株合成葡萄糖酸鈣的影響

2.2.2 碳酸鈣濃度對葡萄糖酸鈣產量的影響 碳酸鈣是合成葡萄糖酸鈣的另一主要底物，也應有足夠的量才能使葡萄糖酸鈣達到一定產量。圖2是不同碳酸鈣濃度下的葡萄糖酸鈣產量，從圖2可以看出，最適的碳酸鈣濃度為400g/L，超過該濃度葡萄糖酸鈣的產量變化不大。

圖2 碳酸鈣濃度對U-69菌株合成葡萄糖酸鈣的影響

2.2.3 硫酸銨濃度對葡萄糖酸鈣產量的影響 硫酸銨是發酵氮源，對合成葡萄糖酸鈣有很重要的影響。圖3是不同硫酸銨濃度下的葡萄糖酸鈣產量，從圖3可以看出，最適的硫酸銨濃度為3～4g/L。

圖3 硫酸銨濃度對葡萄糖酸鈣產量的影響

圖4 pH對U-69菌株合成葡萄糖酸鈣的影響

2.2.4 培養基初始pH和發酵溫度對葡萄糖酸鈣產量的影響 圖4是不同pH下的葡萄糖酸鈣產量，圖5是不同發酵溫度下的葡萄糖酸鈣產量，從圖4和圖5可以看出，培養基初始pH對U-69合成葡萄糖酸鈣有很大的影響。U-69合成葡萄糖酸鈣最適的pH為5.5，最適發酵溫度是30～34℃，在該溫度范圍內，葡萄糖酸鈣的產量是基本上穩定的。

圖5 溫度對U-69菌株合成葡萄糖酸鈣的影響

2.2.5 接種量對葡萄糖酸鈣產量的影響 圖6是不同接種量下的葡萄糖酸鈣產量，從圖6可以看出，接種量對U-69合成葡萄糖酸鈣有很大的影響。U-69合成葡萄糖酸鈣最佳接種量為10%，當接種量不足時，由于菌體生長慢，產生葡萄糖氧化酶能力差，葡萄糖酸鈣的產量則低，當接種量過大時，由于菌體生長快，消耗過多營養，導致產生葡萄糖氧化酶能力差，葡萄糖酸鈣的產量也低。

圖6 接種量對U-69菌株合成葡萄糖酸鈣的影響

2.2.6 發酵液裝液量對葡萄糖酸鈣產量的影響 圖7是不同裝液量下的葡萄糖酸鈣產量，從圖7可以看出，裝液量對U-69合成葡萄糖酸鈣有較大的影響。U-69合成葡萄糖酸鈣最佳裝液量為250mL三角瓶中裝30mL發酵液，這說明U-69需要較充足的氧才能很好地合成葡萄糖酸鈣。

圖7 裝液量對U-69菌株合成葡萄糖酸鈣的影響

2.2.7 發酵時間對葡萄糖酸鈣產量的影響 圖8是不同發酵時間的葡萄糖酸鈣產量，從圖8可以看出，U-69發酵10h即可大量合成葡萄糖酸鈣，至18h達到了最大合成量，隨著發酵時間的進一步增加，葡萄糖酸鈣的產量變化不大。

從以上實驗結果可知，各因素的最佳值為葡萄糖150g/L，碳酸鈣400g/L，硫酸銨3～4g/L，pH 5.5，250mL三角瓶裝30mL發酵液，接種量10%，30～ 34℃發酵18h。

圖8 發酵時間對U-69菌株合成葡萄糖酸鈣的影響

3 討論

葡萄糖結構類似物如2-脫氧-D-葡萄糖抗性菌株的篩選已被證明可用于葡萄糖淀粉酶、纖維素酶和葡萄糖氧化酶高產菌株的篩選［5-7］。本研究采用2-脫氧-D-葡萄糖抗性菌株與產葡萄糖氧化酶活性的相關性的特性進行篩選，獲得了較好的效果，所獲得的7個2-脫氧-D-葡萄糖抗性菌株全部具有較高的產葡萄糖氧化酶活性。由此可以推測，增加2-脫氧-D-葡萄糖耐受性，可以是一個改善原始菌株產酶綜合性能的有效手段。

藍圈法的原理是微生物產生的葡萄糖氧化酶將培養基中的葡萄糖轉化為葡萄糖酸，葡萄糖酸與KI反應將I-離子還原為I元素，I與培養基中的可溶性淀粉反應形成藍色化合物而使菌落周圍出現藍色圈，藍色圈的大小與葡萄糖氧化酶的產量成正相關。該方法可以作為葡萄糖氧化酶產生菌的高通量篩選方法，大大提高葡萄糖氧化酶產生菌的誘變育種效率。

［1］李艷，李靜.葡萄糖氧化酶及其應用［J］.食品工程，2006（3）：9-11.

［2］劉峰，黃鷺強，林穎，等.從土壤中快速篩選葡萄糖氧化酶產生菌及發酵工藝的優化［J］.生物技術，2007，17（3）：64-68.

［3］聶芙蓉，劉慶華，杜壘，等.不同指示劑對EDTA法測定飼料中鈣含量準確性影響的研究［J］.飼料工業，2006，27（6）：54-55.

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Study on mutagenesis of oxidase-producing Aspergillus niger and its fermentation condition of calcium gluconate production

LIANG Jing-juan，LI Xiao-yu，GUAN Wei，PANG Zong-wen，MAI Zhi-mao
（College of Life Science and Technology，Guangxi University，Nanning 530005，China）

The glucose oxidase production capacity of Aspergillus niger P-9 was improved by mutagenesis using UV-or60Co-irradiation and selected in 2-deoxy-D-glucose agar.7 strains which were resistant to 2-deoxy-D-glucose，4 strains had higher glucose oxidase production capacity than wild-type strain P-9.The glucose oxidase activity of the best producer，strain U-69（28.7U/mL），was 2.5 times higher than strain P-9.The fermentation conditions of U-69 for calcium gluconate production were studied.The optimum fermentation conditions of U-69 to produce glucose oxidase were 150g/L glucose，400g/L CaCO4，3～4g/L（NH4）2SO4，30mL broth bottled in 250mL triangular flask，pH 5.5，inoculum size 10%，30～34℃and 18h.

Aspergillus niger；glucose oxidase；mutagenesis；calcium gluconate

TS201.3

A

1002-0306（2010）12-0218-03

2009-12-27

梁靜娟（1964-），女，碩士，副教授，研究方向：微生物酶學。