脈沖場凝膠電泳實驗中的問題及解決方案

陳秋芳,焦湞,押輝遠

（1.鄭州大學離子束生物工程重點實驗室,河南鄭州 450052；2.洛陽師范學院,河南洛陽 471022）

脈沖場凝膠電泳實驗中的問題及解決方案

陳秋芳1,焦湞1,押輝遠2

（1.鄭州大學離子束生物工程重點實驗室,河南鄭州 450052；2.洛陽師范學院,河南洛陽 471022）

脈沖場凝膠電泳是分離大分子DNA片段的有效方法.就脈沖場凝膠實驗中遇到的問題及解決方法進行了探討,在充分理解實驗原理的基礎上對脈沖場凝膠電泳的實驗條件進行優化,最終達到利用脈沖場凝膠電泳得到大分子DNA片段清晰整齊電泳條帶的實驗效果,為后續實驗奠定了基礎.

脈沖電泳；大分子DNA；條件優化

脈沖凝膠電泳（pulsed field gelelectrophoresis,PFGE）是近年來發展起來的一種分離大片段DNA的電泳技術,在現代分子生物學研究中得到了廣泛的應用[1-3].普通的瓊脂糖凝膠電泳是借助瓊脂糖凝膠的分子篩作用,核酸片段因其分子量或分子形狀不同,電泳移動速度有差異而分離,然而這項技術只能分離15～20 kb以下的小分子DNA以及質粒DNA分子,更大的DNA分離用普通瓊脂糖凝膠電泳無法達到分離的目的,從而限制了染色體DNA的分離、生物物種鑒定、微生物基因分型、人類染色體內切酶物理圖譜分析等方面的研究.1984年,Schwartz和Centor發明了脈沖場凝膠電泳技術,并成功實現了釀酒酵母菌細胞16條染色體DNA的分離[4].目前PEGE技術可以分離1～10Mb的DNA片段,為真核生物染色體DNA或大片段DNA的研究提供了新的工具,已經在生物物種的鑒定、核型分析以及生物基因組結構的研究方面的到廣泛應用[5-7].本文簡述了PEGE的原理,并在實驗教學時引導學生優化了利用PFGE分離小麥BAC質粒限制性酶切片段的實驗方法,為進行下一步的Southern雜交實驗、達到進行更加精細的遺傳圖譜分析以及同源性檢查的實驗目的奠定基礎.

1 PEGE的原理

瓊脂糖凝膠電泳利用DNA分子在泳動時的電荷效應和分子篩效應可以分離20 kb以下的DNA分子片段.大于20 kb的線性DNA雙鏈片段,在電場作用下通過孔徑小于分子大小的凝膠時,將會改變無規卷曲的構象,沿電場方向伸直,與電場平行從而才能通過凝膠.此時,大分子通過凝膠的方式相同,遷移率無差別,不能分離.PFGE采用了兩個交變電場,即兩個電場交替的開啟和關閉,當某一電場開啟時, DNA分子即順著此電場的方向拉長和延展,以“爬行”的方式穿過凝膠孔.如果電場方向改變,DNA分子必須先掉轉頭來,才能沿著新的電場方向泳動.較小的分子位移的時間相對減少,較大的分子則需要較多的時間來改變方向,從而將不同大小的分子分開.人們用稀有位點的限制性內切酶對細菌的染色體DNA進行消化,得到較大的片段,然后進行PFGE電泳,可將不同大小DNA片段分開,穩定性好,分辨率高.

2 PEGE的應用及實驗條件優化

2.1 實驗材料與方法

2.1.1 實驗材料 從小麥品種小偃54構建的DNA BAC文庫篩選到的特定基因的BAC克隆,編號為838-5-3,907-5-16,907-7-15,1257-1-11,1258-1-16.

2.1.2 實驗儀器 美國伯樂公司（BIO-RAD）的CHEF-DRⅢ脈沖電泳儀（Richmond,California）.Marker為λHindⅢ.質粒提取采用溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Qiagene的質粒提取試劑盒兩種方法提取.

2.1.3 實驗方法 取適量的BACDNA及限制性內切酶（1μg BACDNA,3單位限制性內切酶）,在適宜溫度培養3～4 h.限制性內切酶BamHⅠ和NotⅠ購自大連寶生物.取適量酶切后的BAC質粒DNA在脈沖電泳儀中電泳,將DNA酶切產物電泳瓊脂糖凝膠置于EB中染色20min,蒸餾水清洗10～15min.在凝膠成像系統下掃描,存圖.

2.2 實驗條件優化

2.2.1 質粒提取 從節約成本的角度出發,首先用溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ提取的質粒,經過酶切后（30μL體系）,全部點樣,脈沖電泳后沒有條帶,可能用這種方法提取的質粒純度較低,酶切量少.然后用Qiagene的質粒提取試劑盒提取質粒,純度高較高（見圖1）,適宜用于下一步的酶切及電泳分離.

圖1 試劑盒提取的BAC質粒電泳照片

2.2.2 脈沖電泳實驗條件優化 選用BamHⅠ對于提取的5個BAC克隆質粒進行酶切,根據詹勇華等的電泳條件[8],實驗開始采用的脈沖電泳條件是：16 h,1%瓊脂糖凝膠,0.5×TBE,溫度14℃,電場夾角120°,起始脈沖時間5 s,終止脈沖時間15 s,電壓6 V/cm.圖2 A顯示了這些BAC克隆酶切后脈沖電泳的效果.從圖2A可以看出,脈沖電泳的酶切條帶有些彎曲,條帶分離得不好,而且不夠清晰.為此,實驗調整了脈沖電泳的電場強度,從6 V/cm降為5 V/cm,時間從16 h縮短到12 h,其他條件不變,再次對酶切產物進行脈沖場凝膠電泳分離（圖2 B）,從圖2可以看出,用5 V/cm的脈沖場電場可以獲得清晰的電泳分離條帶,為下一步的Southern雜交實驗奠定了基礎.

圖2 小麥5個BAC克隆質粒的BamHⅠ酶切脈沖電泳照片

為了進一步驗證實驗方法的可靠性,選用NotⅠ酶切篩選到的5個BAC質粒,用優化后的方法進行脈沖電泳分離,同樣可以得到清晰的電泳條帶（見圖3）.因此,經過優化后的脈沖實驗條件是：12 h,1%瓊脂糖凝膠,0.5×TBE,溫度14℃,電場夾角120°,起始脈沖時間5 s,終止脈沖時間15 s,電壓5 V/cm.這樣的脈沖實驗條件可以很好地分離小麥BAC質粒的酶切片段.

3 討論

圖3 小麥5個BAC克隆質粒的NotⅠ酶切脈沖電泳照片

PFGE作為一種有效的分離大片段DNA的電泳方法在現代分子生物學研究中得到了廣泛的應用.因此如何掌握這門實驗技能,以及根據脈沖電泳的實驗原理解決實驗過程中遇到的問題至關重要.筆者認為在脈沖電泳實驗中應該注意一下幾個方面的問題：

（1）配制瓊脂糖膠時,可以根據需要分離的DNA片段的大小來調節瓊脂糖膠的濃度；在倒完瓊脂糖膠后用75%的酒精噴膠面,可以防止膠面有氣泡.

（2）定時更換新的緩沖溶液,更換緩沖溶液要時盡可能小心不要碰壞瓊脂凝膠.

（3）確保電泳槽是水平的.如果不水平,調整槽底部的旋鈕,注意不要觸碰電極.

（4）電泳開始前,打開主機和泵的開關,確保電泳緩沖溶液在冷卻泵的作用下在管道中正常循環流動,等電泳緩沖溶液溫度降到設定的14℃再把點樣后的瓊脂糖凝膠放進電泳槽中電泳.

（5）較低的脈沖電場電壓能夠產生較整齊的條帶,可以根據需要分離的DNA分子大小來適當調節電場強度,大的DNA分子需要較低的電場強度.

（6）脈沖電泳時間根據所需分離的DNA分子大小確定.

總之,分離較大的DNA分子需要較小的瓊脂糖膠濃度、較長的轉換時間、較低的電場強度、較低的電場角度、較長的電泳運行時間,較低的緩沖溶液溫度可以得到較為清晰的電泳條帶,學生只有徹底理解脈沖電泳的實驗原理,才能在實驗過程中就遇到的問題提出切實可行的解決策略和實驗方案.

[1]Kato H,Kato N,Watanabe K,et al.Application of typing by pulsed-field gelelectrophoresis to the study ofClostridium difficilein aneonatal intensive careunit[J].JClin Microbiol,1994,32：2067-2070.

[2]Davis A,Hancock D D,Besser TE,et al.Evaluation of pulsed field gel electrophoresis as a tool for determining the degree of genetic relatednessbetween stainsofEscherichia coliO157：H7[J].JClin Microbol,2003,41（5）：1843-1849.

[3]Yin LF,Luo CX,KusabaM,et al.Analysisof theabnormalsegregation ofpathogenicity inMagnaporthe grise aby usinga genetic crossofOryzaandEleusineisolates[J].AgriculturalSciences in China,2010,9（3）：383-391.

[4]Schwartz D C,Cantor C R.Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis[J].Cell, 1984,37（1）：67-75.

[5]Talbot N J,Oliver R P,Coddington A.Pulsed field gel electrophoresis reveals chromosome length differences between strains ofCladosporium fulvum（syn.Fulvia fulva）[J].MolGen Genet,1991,229：267-272.

[6]Orbach M J,Chum ley F G,Valent B.Electrophoretic karyotypes ofMagnaporthe griseapathogens of diverse grasses[J].Mol Plant-Microbe Interact,1996,9：261-271.

[7]付曉燕,胡克興,范黎.脈沖場凝膠電泳技術及其在真菌學研究中的應用[J].微生物學通報,2006,33（1）：144-147.

[8]詹勇華,陳創夫,高劍鋒,等.脈沖場凝膠電泳在BAC文庫插入片段分析中的應用[J].內蒙古農業科技,2006（2）：32-33.

Discussion on the problem s and countermeasures in the pulsed field gel electrophoresis experiment

Chen Qiufang1,Jiao Zhen1,Ya Huiyuan2
（1.Henan ProvincialKey Laboratory of Ion Beam Bio-engineering,Zhengzhou University, Zhengzhou 450052,China；2.College of Life Sciences Luoyang,NormalUniversity,Luoyang 471022,China）

Pulsed field gel electrophoresis（PFGE）is an effective technique of gel electrophoresis which can be used to separate large DNA.This paper discusses the solutions to the problems encountered in the process of pulsed field gel electrophoresis experimental teaching.The pulsed field gel electrophoresis experiment parameters are optimized on the basis of fully understanding the principle of PFGE.Eventually,we can use the pulse field gel electrophoresis to get the better electrophoresis bands ofmacromolecular DNA fragments.Thiswill lay the foundations for a further research.

pulsed field gel electrophoresis,large DNA,optimization of experimental parameters

Q503

A

1008-7516（2011）05-0055-03

10.3969/j.issn.1008-7516.2011.05.014

2011-07-23

國家自然科學基金（30800204）

陳秋芳（1972-）,女,河南伊川人,博士,工程師.主要從事離子束生物工程研究.

盧奇）