厄洛替尼聯合survivin siRNA對人肺腺癌細胞A549增殖的影響

谷 蕾，呂喜英

（1.承德醫學院，河北承德 067000；2.承德醫學院附屬醫院放化療科）

厄洛替尼聯合survivin siRNA對人肺腺癌細胞A549增殖的影響

谷 蕾1，呂喜英2△

（1.承德醫學院，河北承德 067000；2.承德醫學院附屬醫院放化療科）

目的:探討厄洛替尼聯合survivin siRNA對人肺腺癌細胞A549的作用。方法:survivin siRNA轉染、厄洛替尼單獨或聯合應用于人肺腺癌細胞A549，應用四甲基偶氮唑藍(MTT）比色法觀察對A549細胞的增殖抑制作用，免疫組化染色法觀察A549細胞Survivin蛋白的表達情況。結果:survivin siRNA轉染聯合厄洛替尼對A549細胞具有明顯的抑制作用，且可明顯降低A549細胞Survivin蛋白的表達，與單獨應用survivin siRNA轉染和厄洛替尼比較均有統計學意義(P＜0.01）。結論:應用siRNA沉默survivin表達可提高人肺腺癌細胞A549對厄洛替尼的敏感性。

厄洛替尼；survivin siRNA；人肺腺癌A549細胞

Survivin表達于包括肺癌在內的幾乎所有惡性腫瘤組織中。厄洛替尼(Erlotinib)為口服的I型人表皮生長因子受體(HER1/EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(TKI），用于化療方案失敗的局部晚期或轉移的非小細胞肺癌(NSCLC）的二線治療。本研究觀察了厄洛替尼聯合survivin siRNA對人肺腺癌細胞A549的增殖抑制作用，探討二者聯合應用是否具有協同效應，以及survivin siRNA是否增強厄洛替尼的抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1.1 材料 p53野生型肺癌細胞株A549，河北醫科大學第四附屬醫院；靶向survivin的 siRNA、siRNA轉染試劑、siRNA轉染培養基、鼠抗人Survivin蛋白單克隆抗體、β-actin一抗及羊抗鼠二抗，Santa Cruz公司；MTT，上海華舜生物工程有限公司；二甲基亞砜(DMSO），成都天泰公司；二步法免疫組化檢測試劑盒，北京中杉金橋生物技術有限公司；厄洛替尼，上海羅氏制藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：A549細胞接種于50ml培養瓶，用含10%新生牛血清的RPMI l640培養液，于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱內傳代培養，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 survivin siRNA轉染(以6孔板為例）：轉染前1天用0.25%的胰酶消化細胞，將A549細胞以2×105/孔接種于6孔板，至細胞融合約60%-80%時進行轉染，分別用survivin siRNA及陰性對照siRNA-A轉染A549細胞(survivin siRNA與siRNA轉染試劑比例為1：1.2）。

1.2.3 實驗分組：實驗分為5組：空白對照組，siRNAA轉染對照組，survivin siRNA轉染組，厄洛替尼處理組，survivin siRNA轉染+厄洛替尼處理組?？瞻讓φ战M和厄洛替尼處理組細胞用含10%新生牛血清的RPMI l640培養液培養，不進行轉染，其中厄洛替尼處理組細胞加入厄洛替尼，終濃度為12.5μmol/L。siRNA-A轉染對照組，survivin siRNA轉染組，survivin siRNA轉染+厄洛替尼處理組細胞進行轉染，轉染6h后換為含l0%新生牛血清RPMI l640培養液，其中survivin siRNA轉染+厄洛替尼處理組加入厄洛替尼，終濃度為12.5μmol/ L。

1.2.4 MTT比色法檢測細胞增殖：調整A549細胞濃度，以3×103/孔接種于96孔培養板，每組設6個復孔。轉染、加藥處理，48h后各組棄培養液，每孔加入MTT(5mg/ ml)20μl，37℃孵育4h，輕輕吸棄培養液，每孔加入150μl DMSO，振蕩10min。于490nm波長處采用酶聯免疫檢測儀測定各孔光密度(OD)值，計算各組細胞抑制率。抑制率=[(空白對照組OD值-實驗組OD值)/空白對照組OD值]×100%。

1.2.5 免疫組化染色觀察Survivin蛋白表達的變化：細胞爬片后經轉染、加藥處理，培養48h后，采用二步法免疫組化染色方法觀察A549細胞Survivin蛋白的表達，DAB顯色，蘇木素復染。以PBS代替一抗作為陰性對照。以胞漿和(或）細胞核出現棕黃色顆粒為染色陽性。免疫組化染色結果根據陽性細胞百分比及著色強度進行綜合分析：①陽性細胞百分比：隨機選取5個高倍鏡視野(×400），計數100個細胞中的陽性細胞數并計分，0分(＜5%）、l分(5%-25%）、2分（25%-50%）、3分(50%-75%）、4分(＞75%）。②著色程度：不著色為0分，淡黃色(弱陽性）為1分，黃色或深黃色(中等陽性）為2分，褐色或棕褐色(強陽性）為3分。以陽性細胞率和染色強度分值的乘積作為每一例的積分，以積分作為Survivin蛋白的相對表達水平[1]。

2 結果

2.1 MTT法染色結果 siRNA-A轉染對照組細胞增殖未受到明顯抑制。與siRNA-A轉染對照組相比，survivin siRNA轉染組、厄洛替尼處理組及survivin siRNA+厄洛替尼處理組A549細胞增殖受到明顯抑制(P＜0.01）；與survivin siRNA轉染組和厄洛替尼處理組比較，survivin siRNA轉染+厄洛替尼處理組細胞的抑制率明顯升高(P＜0.01）。2×2析因設計的方差分析顯示，survivin siRNA轉染和厄洛替尼處理兩種因素存在交互作用(F=44.105，P＜0.01），表現為協同作用。見附表。

附表 MTT法和免疫組化染色結果(±s）

附表 MTT法和免疫組化染色結果(±s）

與siRNA-A轉染對照組比較:*P＜0.01，與survivin siRNA轉染+厄洛替尼處理組比較:#P＜0.01

組別 抑制率(%) Survivin蛋白空白對照組 --- 8.85±0.67 siRNA-A轉染對照組 0.85±8.24 8.70±0.92厄洛替尼處理組 60.28±3.23*# 3.80±0.62*#survivin siRNA轉染組 47.68±4.09*# 3.40±0.94*#survivin siRNA轉染+厄洛替尼處理組 78.14±4.34* 1.15±0.37*

2.2 A549細胞Survivin蛋白的表達 Surviving蛋白免疫陽性產物位于A549細胞的細胞質和細胞核，空白對照組及siRNA-A轉染對照組可見大量陽性細胞，survivin siRNA轉染組、厄洛替尼處理組及survivin siRNA轉染+厄洛替尼處理組陽性細胞較少(附圖）。Survivin蛋白定量分析結果見附表：survivin siRNA轉染組、厄洛替尼處理組及survivin siRNA轉染+厄洛替尼處理組Survivin蛋白的表達明顯低于空白對照組及siRNA-A轉染對照組(P＜0.01），且survivin siRNA轉染+厄洛替尼處理組明顯低于survivin siRNA轉染組和厄洛替尼處理組(P＜0.01）。

附圖 A549細胞Survivin蛋白的表達(×400)

3 討論

厄洛替尼對肺癌患者相關癥狀具有良好的改善作用，咳嗽、呼吸困難與疼痛的改善率分別可達44%、34%和30%[2]。厄洛替尼不良反應發生率較低，病人耐受性好，對于老年、一般情況較差的晚期NSCLC患者仍是安全有效的選擇。但由于幾乎所有的患者最后都會產生耐藥，限制了其長期療效。厄洛替尼聯合標準含鉑一線化療方案不能額外改善生存率，因此迫切需要尋找能增強厄洛替尼抗腫瘤作用的方法[3]。逃避凋亡是腫瘤發生、發展和藥物抵抗的重要機制[4]。大量研究表明，survivin高表達的腫瘤細胞可耐受化療、放療，下調survivin的表達可增加腫瘤細胞化療、放療時的凋亡[5]。Falleni等[6]的研究顯示了survivin基因在肺癌早期診斷中的價值，也是“基因沉默”治療比較理想的靶點[7]。有研究表明，在哺乳類、人類細胞中直接導入人工合成的siRNA，一方面可避免激活干擾素途徑，另一方面可使相應序列的靶向基因mRNA產生明顯的特異性抑制效應[8]。據此機制，依照靶基因mRNA設計序列特異性siRNA，可起到封閉特異性基因表達的作用。

本研究通過survivin siRNA沉默survivin的表達，并聯合應用厄洛替尼，發現survivin siRNA轉染和厄洛替尼聯用對A549細胞的增殖抑制作用明顯增強，并能顯著降低A549細胞Survivin蛋白的表達水平，明顯優于單獨應用厄洛替尼。因此表明，survivin siRNA轉染和厄洛替尼處理兩種因素具有協同作用，但作用機制有待于進一步研究。本研究證明，轉染survivin siRNA沉默survivin的表達可增強厄洛替尼對A549細胞的增殖抑制作用，降低Survivin蛋白的表達水平，從而增強厄洛替尼的抗腫瘤作用。本研究為提高厄洛替尼對NSCLC的治療效果提供了新的治療思路和實驗依據。

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EFFECTS OF ERLOTINIB COMBINED SURVIVIN SIRNA ON PROLIFERATION OF HUMAN LUNG ADENOCARCINOMA CELL LINE A549

GU Lei, LV Xi-ying
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To investigate the effects of erlotinib combined survivin siRNA on proliferation of human lung adenocarcinoma cell line A549.Methods:The lung adenocarcinoma cell line A549 was treated with survivin siRNA transfection and erlotinib alone or in combination. MTT method was used to observe the inhibitory effects of proliferation on A549 cells, and immunohistochemical staining to observe expression of Survivin protein in A549 cells.Results:Erlotinib combined survivin siRNA had obvious inhibitory effects on A549 cells, and could obviously decreased expression of Survivin protein in A549 cells. There had obvious differences between erlotinib combined survivin siRNA and erlotinib or survivin siRNA alone (P＜0.01).Conclusions:Survivin siRNA silence the expression of survivin can enhance sensitivity of human lung adenocarcinoma cancer cell line A549 to erlotinib.

Erlotinib; Survivin siRNA; A549 cells

R734.2

A

1004-6879(2011）02-0122-03

2010-12-20）

△ 通訊作者