超聲波降解法對殼聚糖結構的影響研究

李軍立，張波，馬力*

（西華大學生物工程學院，成都，610039）

1 引言

甲殼素是由N-乙酰-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖以β-1.4糖苷鍵形式連接而成的多糖，殼聚糖(Chitosan)是甲殼素的N-脫乙酰產物，結構單元是氨基葡萄糖的二糖，一般而言，N-乙?；撊?5%以上的就可稱之為殼聚糖，是自然界中唯一的天然陽離子高聚物[1]，是天然存在的唯一堿性多糖，也被譽為第六大生命要素[2,3], 其pKa值為6.3[4,7]，這種脫乙酰度的殼聚糖能溶于1%的乙酸或者1%的鹽酸。

低分子量(黏均分子量小于5×104)殼聚糖不僅具有一些與殼聚糖相似的性質，而且比高分子量殼聚糖有著更為廣泛的應用，還具有其特殊的生理生化活性，因此，便出現了各種各樣的有關殼聚糖的降解的方法，但這些方法或多或少的對殼聚糖的結構有著一定的影響，而殼聚糖的特殊的生理生化活性與其特殊的分子結構是密不可分的，因此，考究一種方法是否科學可行，是否對殼聚糖結構造成嚴重破壞，是評價這種方法優劣的重要手段，為此，本論文在前人研究的基礎上，來探討超聲波降解法對殼聚糖結構的影響，并驗證這種方法科學可行性。本部分實驗通過單因素實驗來研究超聲功率對殼聚糖結構的影響，并利用紅外光譜法找出最適的超聲波功率范圍。

2 實驗材料與儀器

2.1 實驗材料

殼聚糖(D.D.84.24%、分子量為97013)

濟南海得貝海洋生物工程有限公司

溴化鉀(分析純)

成都市邛崍宏旺化工貿易有限公司

其他所用藥品均為分析純

2.2 實驗儀器

JY92-2D超聲波細胞粉碎機

寧波新芝科器研究所

Heto Lyolab3000冷凍干燥機

安徽省尚馬科工貿有限公司

傅立葉紅外光譜儀

天津市拓普儀器有限公司

2.3 實驗方法

2.3.1 準備實驗

2.3.1.1 原料的預處理

首先，稱取20g的原料殼聚糖加入1000mL預先制備好的1%的鹽酸溶液中，用磁力攪拌器攪拌至殼聚糖充分溶解后，抽濾，除去不溶解的殼聚糖和雜質，收取濾液，再向濾液中加入1mol/L的氫氧化鈉溶液調pH值至9，使得所溶解的殼聚糖充分沉淀，低速離心5min后，棄上清液，回收沉淀，用去離子水反復沖洗沉淀直至pH值為中性，離心分離，重復3～5次后，將沉淀進行冷凍干燥后，密封保存。

2.3.1.2 殼聚糖脫乙酰度測定[8]

準確稱取0.3～0.5g 殼聚糖樣品，置于250 mL燒杯中，加入足量的 0.1mol/L HCl 溶液(30mL)，在20～30℃用磁力攪拌器攪拌2～3 h 至完全溶解，加5至6滴指示劑，用標準0.1mol /L NaOH 溶液滴定,至溶液變成淺藍綠色。另稱取一份樣品，于105℃烘干至恒重，測水分。每個樣品各做三次。通過測定氨基含量，便可以測的殼聚糖的脫乙酰度(D.D.)。

① NH2/%=[(C1V1-C2V2)×0.016/G(100-W)]×100

②脫乙酰度(D.D.)/%=(NH2%/9.94%)×100

式中，C1——鹽酸標準溶液的濃度(mo1/L)；

C2——氫氧化鈉標準溶液的濃度(mo1/)；

V1——加入的鹽酸標準溶液的體積(mL)；

V2——滴定消耗的氫氧化鈉標準溶液的體積(mL)；

G——樣品的質量(g)；

W——樣品中含有的水分(%)；

0.016 ——與1mL的1mol/L鹽酸溶液相當的氨基量(g)

2.3.1.3 殼聚糖分子量測定[9]

本實驗采用烏氏粘度計法測定殼聚糖的分子量，根據下面公式[η]=KMνa可計算出原料殼聚糖的黏均分子量Mν。其中[η]為樣品黏度；K、a為系數，根據脫乙酰度選定相關數值。

2.3.1.4 殼聚糖的超聲波降解

準確稱取1g精制后的殼聚糖溶解于100 mL1%鹽酸溶液中，直至完全溶解，共配制5份，然后分別在超聲功率為350W、400W、450W、500W、550W作用下，將殼聚糖溶液間歇式超聲處理120min(僅計超聲時間)后，超聲降解期間，溫度控制在40℃左右。超聲完成后快速將每份的降解產物在45℃減壓濃縮1h，然后分別對每份用1mol／L NaOH溶液調節溶液的pH值為9，收集沉淀，用丙酮反復洗滌至中性，冷凍真空干燥，利用烏氏黏度計測定每份溶液黏度，即可獲得不同的低聚分子量殼聚糖M1、M2、M3、M4、M5。

2.3.1.5 紅外光譜檢測

采用溴化鉀壓片法對降解后的殼聚糖M1、M2、M3、M4、M5的結構進行檢測，并對降解前后殼聚糖結構發生的變化進行探討。

2.4 實驗結果與分析

2.4.1 殼聚糖脫乙酰度測定結果

① NH2/%=[(C1V1-C2V2)×0.016/G(100-W)]×100

②脫乙酰度(D.D.)/%=(NH2%/9.94%)×100

C1——鹽酸標準溶液的濃度(mo1/L)；本實驗C1=0.0998 mo1/L

C2——氫氧化鈉標準溶液的濃度(mo1/L)；本實驗C2=0.103mo1/L

V1——加入的鹽酸標準溶液的體積(mL)；本實驗V1=30mL

V2——滴定消耗的氫氧化鈉標準溶液的體積(mL)；本實驗平均消耗V2=7.5mL

G——樣品的質量(g)；本實驗G=0.5g

W——樣品中含有的水分(%)；本實驗W=15.0799%

經實驗測定NH2%=8.37%；D.D.%=84.24%

2.4.2 殼聚糖分子量測定結果

由實驗測定可知，殼聚糖黏度[η]=87.27mL·g-1，通過查閱資料可得K=1.424×10-3mol/g，a=0.96，代入公式[η]=KMνa便可以得到原料殼聚糖的黏均分子量97013。

2.4.3 殼聚糖超聲波降解結果與分析

5份殼聚糖試樣在降解溫度、超聲時間、溶液濃度一定，超聲功率不同的條件下，降解后每份溶液黏度、分子量與功率的關系如表2.1。

表2.1 超聲功率與降解后溶液黏度和分子量的關系

2.4.4 降解產物的紅外光譜與分析

按照2.3.1.5的使用方法測定原料殼聚糖經過不同功率超聲波降解后，各分子量大小的殼聚糖的紅外光譜圖實驗結果如下：

(1) 原料殼聚糖的紅外檢測結果與分析

按照按照2.3.1.5的使用方法測定降解后殼聚糖的紅外譜圖見圖2.1。

由圖2.1可知，在3402.52cm-1左右的寬峰是O─H的伸縮振動吸收峰與N─H的伸縮振動吸收峰重疊而成的多重吸收峰，并對應于殘糖基上的羥基和氨基，并且這個峰的寬窄可以反映出分子內和分子間氫鍵的強弱程度，在2919 cm-1～2880 cm-1之間分別對應著殘糖基上的甲基或次甲基的C─H伸縮振動吸收峰，圖2.2中并不是很明顯。原料殼聚糖的酰胺Ⅰ譜帶在1651.80 cm-1左右，為α-殼聚糖，β-殼聚糖為1631cm-1左右[10]，此吸收峰的強弱可以判斷殼聚糖的晶型，并反映的乙酰氨基[11]，該峰的強弱與脫乙酰度有直接關系。原料殼聚糖的酰胺Ⅱ譜帶在1557 cm-1左右，該吸收峰在各文獻中的報道差異較大，有時相差50cm-1左右[12]，脫乙酰度的高低決定了殼聚糖分子中酰胺基團參與分子內和分子間的氫鍵的數目和種類不同，因此該吸收峰的強弱也反映了脫乙酰度的高低。該殼聚糖的酰胺Ⅲ譜帶在1400cm-1左右，由圖2.1可知，殼聚糖的C─H彎曲和─CH3對稱變形振動吸收峰為1398cm-1。C6─OH是一級羥基，在1091.39cm-1有特征吸收峰，而C3─OH是二級羥基，在1120cm-1有特征吸收峰，這兩個特征吸收峰用于檢測甲殼素或者殼聚糖的衍生化反應，用處很大，只要測出這兩個峰的峰面積或峰高就可以知道反應是發生在一級羥基上還是在二級羥基上。

(2) 350W超聲波降解后的殼聚糖紅外檢測結果與分析

同樣按照按照2.3.1.5的使用方法測定降解后殼聚糖的紅外譜圖見圖2.2。

由圖2.2可知，O─H的伸縮振動吸收峰與N─H的伸縮振動吸收峰重疊而成的多重吸收峰出現在3402.80cm-1左右，與原料殼聚糖相比，無顯著變化，并且殘糖基上的甲基或次甲基的C─H伸縮振動吸收峰也無顯著變化。殼聚糖的酰胺Ⅰ譜帶在1651.79 cm-1左右，與原料極為接近，說明殼聚糖的晶型未發生改變，脫乙酰度未發生較大改變。殼聚糖的酰胺Ⅲ譜帶在1389.10 cm-1左右與原料殼聚糖接近，并且一級羥基和二級羥基均與原料殼聚糖接近，因此，在超聲功率為350W下超聲兩小時，除了分子量降低外并未對殼聚糖的結構造成顯著影響。

(3) 400W超聲波降解后的殼聚糖紅外檢測結果與分析

同樣按照按照2.3.1.5的使用方法測定降解后殼聚糖的紅外譜圖見圖2.3。

由圖2.3可知，在400W超聲波下降解兩小時后的殼聚糖的結構與原料殼聚糖的結構相比，未發生顯著變化，降解后的殼聚糖的O─H的伸縮振動吸收峰與N─H的伸縮振動吸收峰重疊而成的多重吸收峰均在3042 cm-1左右，說明殼聚糖分子內和分子間的氫鍵作用并未發生顯著變化。

(4) 450W超聲波降解后的殼聚糖紅外檢測結果與分析

同樣按照按照2.3.1.5的使用方法測定降解后殼聚糖的紅外譜圖見圖2.4。

由圖2.4可知，O─H的伸縮振動吸收峰與N─H的伸縮振動吸收峰重疊而成的多重吸收峰出現在3438.14 cm-1左右，可能是因為殼聚糖分子內和分子間氫鍵作用的改變所致，同樣一級羥基C6─OH也發生較小位移，總的來說，超聲功率為450W的超聲波，對殼聚糖降解后的結構影響不顯著。

(5) 500W超聲波降解后的殼聚糖紅外檢測結果與分析

原料殼聚糖在超聲功率為500W的超聲波下作用兩小時后的紅外光譜結果如下：

由圖2.5可知，降解后的殼聚糖的O─H的伸縮振動吸收峰與N─H的伸縮振動吸收峰重疊而成的多重吸收峰出現在3424.43cm-1左右，與原料殼聚糖的吸收峰接出現位置相比發生位移，說明了殼聚糖分子內和分子間的氫鍵作用有所改變，殼聚糖的C─H彎曲和─CH3對稱變形振動吸收峰也發生較小的位移，總的來說殼聚糖的基本結構未發生顯著性變化。

(6) 550W超聲波降解后的殼聚糖紅外檢測結果與分析

同樣按照按照2.3.1.5的使用方法測定降解后殼聚糖的紅外譜圖見圖2.6。

由圖2.6可知，殼聚糖的O─H的伸縮振動吸收峰與N─H的伸縮振動吸收峰重疊而成的多重吸收峰的峰寬較原料殼聚糖的峰寬變窄，原因是殼聚糖分子內和分子間的氫鍵被削弱所致，并且降解后殼聚糖的酰胺Ⅰ譜帶吸收峰出現在1634.28 cm-1左右，較原料殼聚糖發生較嚴重的偏移，可能是因為殼聚糖的乙酰氨基含量發生了較大變化，此外，還在3585.53 cm-1處出現了吸收峰，原因是樣品中含有微量的結晶水或游離水所致?？偟膩碚f，550W的超聲波對殼聚糖降解后結構的影響較顯著。

3 結論

通過超聲波降解殼聚糖的研究結果表明，隨著超聲功率的增加，降解后殼聚糖的結構的影響也逐漸增加，為了保證降解后殼聚糖的結構不發生顯著變化，并結合其他原因，所采用的超聲波超聲功率不宜超過550W，并可以得到質量優良的低聚殼聚糖。

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