一株多菌靈降解菌包埋條件及降解特性

竇晶晶,馮貴穎,呼世斌*,李 琳(.西北農林科技大學資源環境學院,陜西 楊凌 700；.西北農林科技大學理學院,陜西 楊凌 700；.中國水利水電第三工程局勘測設計研究院,陜西 西安 7006)

一株多菌靈降解菌包埋條件及降解特性

竇晶晶1,馮貴穎2,呼世斌2*,李 琳3(1.西北農林科技大學資源環境學院,陜西 楊凌 712100；2.西北農林科技大學理學院,陜西 楊凌 712100；3.中國水利水電第三工程局勘測設計研究院,陜西 西安 710016)

采用海藻酸鈉(SA)和聚乙烯醇(PVA)對 1株多菌靈降解菌進行包埋,并對最佳包埋條件及包埋后的降解效果進行研究.結果表明:SA包埋法的最佳條件為:菌液與2% SA按1:5體積比混合,在4% CaCl2溶液中室溫交聯24h.PVA包埋法的最佳條件為:菌液與10%PVA按1:5比例混合,在3%CaCl2溶液中室溫交聯24h.活化48h后,在30℃、 pH6的條件下,SA包埋的多菌靈降解菌對多菌靈的降解率可達80.4%.PVA包埋的降解菌的降解率為76.3%.

多菌靈；降解菌；包埋條件優化；降解特性

多菌靈(MBC)是一種高效廣譜低毒的內吸性殺菌劑,常用于蔬菜和谷類的病害防治,性質穩定難降解,易對生態環境造成威害.已有研究[1-2]結果表明,微生物降解是沉積環境中多菌靈去除的主要途徑.如果篩選的微生物抗不良環境能力較弱,將使其在自然環境中的降解性能受到影響.固定化微生物技術可以將優勢菌種固定,可保持較高的活性[3],提高降解效率[4-5],且被固定化后的細胞具有反應速率快、耐毒害能力強[6]等優勢.固定化技術的包埋法是利用線性網狀結構的高分子聚合物的加裹作用,使優勢菌通過擴散進入多孔載體內,或利用高聚物在形成凝膠時將優勢菌包埋于內部[7].包埋形成的載體可防止細胞滲出,但底物仍能滲入并與細胞發生作用.本研究探討海藻酸鈉與聚乙烯醇包埋多菌靈降解菌的條件和降解特性,以期為包埋技術在農藥降解的研究方面提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

多菌靈降解菌株屬產堿菌屬(Alcaligenes sp.),由西北農林科技大學污染控制研究中心從長期使用多菌靈的土壤中富集分離獲得.

多菌靈原藥純度為97.5%,海藻酸鈉(SA)、聚乙烯醇(PVA)等試劑均為分析純.

基礎鹽培養基(g/L):NaCl 1.0,NH4NO31.0,K2HPO41.5,KH2PO40.5,MgSO4·7H2O 0.1,FeSO4·7H2O 0.01,蒸餾水1000mL , pH值調至7.0左右.

LB 培養基(g/L):蛋白胨 10.0,酵母膏 5.0,NaCl 5.0 .

1.2 實驗方法

1.2.1 SA包埋 在室溫條件下,按表 1所設定的比例,將 SA于蒸餾水中加熱至完全溶解,冷卻后與培養 48h的多菌靈降解菌的菌液混合均勻.用注射器將混合液滴入 CaCl2溶液中形成均勻小球,交聯一段時間后將固定化小球取出,用0.9%的NaCl溶液洗滌后保存備用.

表1 SA正交實驗表Table 1 The orthogonal experiment table of SA

SA包埋條件的確定:以交聯時間、SA和CaCl2濃度以及為因素,每個因素設 3個水平.以固定化小球對多菌靈的去除率為目標函數,采用L9(34)正交表進行正交實驗,確定最佳包埋條件.其他條件為:多菌靈初始濃度 250mg/L,菌液接入量20%(V/V)、LB培養基與固定化小球的體積比為 10:1,基礎鹽培養基加入量 25%(V/V)、溫度30℃,初始 pH6,搖床轉速為 150r/min,活化時間48h,培養時間48h.

1.2.2 PVA包埋 在室溫條件下,按表2所設定的比例,將PVA與SA按10∶1混合加熱至完全溶解,冷卻后與培養 48h多菌靈降解菌的菌液混合均勻.用注射器將其滴入 CaCl2的飽和硼酸溶液中成球,交聯一定時間后將固定化小球取出,用0.9%的NaCl溶液洗滌保存備用.

PVA包埋條件確定:選定交聯時間、PVA和CaCl2濃度為因素,并設3個水平.以固定化小球對多菌靈的去除率為目標函數,采用 L9(34)正交表進行正交實驗,探討最佳的包埋條件.其他條件為:PVA 濃度與SA濃度比例10∶1,多菌靈初始濃度、菌液接入量、基礎鹽培養基加入量等與

1.2.1 相同.

表2 PVA正交實驗表Table 2 The orthogonal experiment table of PVA

1.2.3 包菌小球的物理性質測定 彈性系數的測定:選取3 顆形態完好、大小均勻的小球呈品字形置于載玻片上,并放上蓋玻片.測量載玻片與蓋玻片之間的高度H1,選取適當的砝碼置于蓋玻片上,測量固定化小球被壓縮后的高度H2,據式(1)計算固定化小球的彈性系數.

式中:g為重力常數,取值9.8N/kg.

包菌小球直徑的測定:選取 5個大小均勻的包菌小球,用游標卡尺測其直徑,計算平均直徑.

傳質性能的測定:選取50個小球于50mL紅墨水中.放置24h后,于460nm分別測定加入包菌小球前后的紅墨水吸光度,計算固定化小球吸附紅墨水的百分比,判斷傳質性能的差異.

1.2.4 包埋小球降解能力的測定 降解菌的培養:從平板上挑取多菌靈降解菌的單菌落,接種于50mL LB培養基中,于30℃、120r/min培養48h作為包埋菌液.

包菌小球的活化:將包菌小球置于 LB培養基中,于30℃、120r/min活化48h.

包菌小球降解條件的研究:將包菌小球置于多菌靈 250mg/L的基礎鹽培養基中,于 30℃、120r/min培養.采用三波長校正光度法對小球的降解能力進行分析[8].

標準曲線的繪制:吸取多菌靈標準液 0,0.10,0.20,0.40,0.60,0.80,1.00mL,用 1cm 石英比色皿,以鹽酸(HCl與H2O為1∶11)調節分光光度計零點,分別測定278、281和290nm波長的吸光度.根據ΔA = A281-(A278+ A290)/2計算校正吸光度ΔA ,再以ΔA為縱坐標,多菌靈的含量為橫坐標,繪制標準曲線.

培養液中多菌靈的提取:取一定量的培養液,加 HCl酸化至 pH 1～2.用 CHCl3提取 2次,每次25mL,合并提取液,水洗1次,水洗液合并入水層,用于多菌靈測定.

1.2.5 包菌小球最適降解條件的研究 溫度:將活化后的包菌小球,置于含多菌靈的基礎鹽培養基中,在20,25,30,35,40℃搖床培養后,于48h取樣檢測多菌靈含量.

pH 值:將活化后的包菌小球,置于含多菌靈的不同pH值(5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0)的基礎鹽培養基中,30℃、120r/min搖床培養,48h后取樣檢測多菌靈的含量.

接種量:按1:10,2:10,3:10的接種量接入活化后的包菌小球,于 30℃、120r/min搖床培養,48h后取樣檢測多菌靈含量.

農藥初始濃度:將活化后的包菌小球置于含多菌靈50,100,150,200,250和300mg/L的基礎鹽培養基中,于30℃、120r/min 搖床培養,48h后取樣檢測多菌靈含量.

活化時間:包菌小球于 LB培養基中活化24,36,48,60,72h后,置于含多菌靈的基礎鹽培養基中,30℃、120r/min搖床培養,48h后取樣檢測多菌靈含量.

實驗均以不接菌液為空白,以相同菌液含量的游離多菌靈降解菌培養液為對照,按散菌的接入體積計算出相應的包菌小球體積,每個處理重復3次.

2 結果與分析

2.1 SA包埋條件的確定

以交聯時間、SA和CaCl2濃度為因素,正交實驗結果見表3.

表3顯示,在所選取的3個因素中,對降解效果影響最大的是交聯時間,最小的是 CaCl2濃度.這是因為交聯時間不足,SA與鈣離子沒有充分形成鈣凝膠,導致包埋小球的強度不足,從而影響微生物的附著以及生長;交聯時間過長,凝膠的強度過高,影響包埋小球的傳質性能,也無法獲得良好的去除效果[9].另外,SA 濃度越高,包埋后的小球傳質性能越差,氧氣以及反應底物的擴散阻力越大,固定化微生物反應活性受到抑制[10].結果表明,SA濃度2%時,多菌靈降解菌的降解效果最好(80.4%).因此,后續實驗選取SA濃度2%,CaCl2濃度4%,交聯24h.

表3 SA正交實驗結果Table 3 The orthogonal experiment results of SA

2.2 PVA包埋條件的確定

選定交聯時間、PVA和 CaCl2濃度為因素,正交實驗得到的最佳包埋條件見表4.

表4 PVA正交實驗結果Table 4 The orthogonal experiment results of PVA

從正交實驗結果(表4)可以看出,3個因素中,對PVA包埋的降解效果影響大小依次是:交聯時間＞ PVA 濃度＞ CaCl2濃度.交聯時間越長,多菌靈的去除效果越差.PVA濃度對包埋效果的影響與海藻酸鈉的影響相似:即濃度越高,包埋后的小球密度越高,傳質性能越差,氧氣以及反應底物的擴散阻力越大,固定化的微生物反應活性受到抑制[11].由于硼酸對微生物有毒性作用,包埋劑中的 SA作為多糖類天然高分子化合物,對微生物細胞有保護作用,因此提高了固定化細胞的相對活性[12].當PVA濃度為10%時,48h多菌靈的去除率達到76.3%,而游離微生物在同樣條件下120h的降解率僅為70%[13].因此,確定PVA濃度10%、CaCl2濃度3%,交聯24h為最適包埋條件.

2.3 包菌小球的物理性質

2.3.1 彈性系數 固定化小球的彈性系數直接表征小球的強度.當SA的濃度為2%,3%和4%時,彈性系數分別為9.85,11.23和13.81N/m;當PVA的濃度為 9%,10%和 11%時,彈性系數分別為14.82,16.50和18.60N/m.結果表明:同一包埋材料不同濃度的包菌小球彈性系數不同,包埋劑濃度越大,包菌小球的彈性系數越高.

2.3.2 傳質性能 固定化小球對墨水中的紅色物質有吸附作用.若紅墨水的吸光度大,說明固定化小球吸收的紅色物質少,傳質性能較差,反之亦然.SA和PVA包埋小球的傳質性能分別為27.2%和13.6%.

2.3.3 包菌小球直徑 SA包埋小球與PVA包埋小球的平均直徑分別為0.268cm和0.322cm.

2.4 包菌小球的最適降解條件

2.4.1 溫度對包菌小球降解多菌靈的影響 隨溫度的升高,包菌小球對多菌靈的降解呈先升高后降低的變化(圖1).30℃,SA和PVA包菌小球對多菌靈的降解效果最好,散菌、SA和 PVA包菌小球的多菌靈降解率分別為 63.6%,81.5%和73.3%.可以看出,通過SA和 PVA的包埋,多菌靈降解菌的降解效果高于未包埋的散菌.溫度從20℃提高到 30℃,SA包菌小球對多菌靈的降解率較PVA包菌小球高約15%左右;繼續升高溫度,2種包菌小球的降解率均下降,尤以 SA包菌小球下降明顯.這可能是由于 SA機械性能較差,溫度升高,SA受熱軟化,內部的多菌靈降解菌受到外界溫度的影響,致使活性降低.

圖1 溫度對包菌小球降解多菌靈的影響Fig.1 Temperature influence on carbendazim degradation rate of embedded bacteria

2.4.2 pH值對包菌小球降解多菌靈的影響圖2顯示,體系的pH值為5時,散菌、SA與PVA包菌小球的多菌靈降解率分別為20.0%,51.9%和56.8%.pH值為7時,散菌、SA與PVA包菌小球的多菌靈降解率分別為 40.3%,48.8%和 53.3%.研究結果表明,pH5.5～6.5范圍,多菌靈降解菌的降解率較高;在pH6時,SA與PVA包菌小球的降解率為 76.8%和 78.9%,散菌的降解率為 52.5%.研究結果說明,經過SA和PVA的包埋,多菌靈降解菌的降解活性得到提高.

圖2 pH值對包菌小球降解多菌靈的影響Fig.2 pH influence on carbendazim degradation rate of embedded bacteria

這是因為體系的pH＜6時,H+濃度較高,H+可能會與某些營養物質結合,并能從這些物質或微生物細胞表面置換出某些陽離子,從而影響微生物細胞的結構穩定性和活性,導致包菌小球對多菌靈的去除率下降.當體系的 pH＞7,OH-的濃度較高,會影響營養物質的溶解度、微生物細胞表面的電荷平衡和膠體性質,也可能導致固定化細胞活性的降低,從而影響包菌小球對多菌靈的去除率[14].

2.4.3 接種量對包菌小球降解多菌靈的影響圖 3表明,SA包埋中降解菌的接種量為 1:10,2:10,3:10時,降解8h,去除率分別為41.2%,43.5%和 45.2%;降解時間延長到 48h,去除率分別達到72.3%,74.6%和68.5%.從圖4可知,PVA包埋降解菌的接種量為1:10,2:10, 3:10時,降解8h,去除率分別為51.2%, 54.5%和55.6%;繼續增加到48h,去除率分別為74.6%,77.2%和76.8%.從8h到24h,降解率提高了約 15%,此時體系中的反應底物、氧氣和營養物質等逐漸滲透到包菌小球內部,微生物開始快速生長和大量繁殖.在24h～48h范圍,體系中的反應底物、氧氣和營養物質的滲透達到平衡,微生物之間、微生物細胞之間對營養物質的競爭,導致整體細胞活性的下降,到48h時降解達到平衡[15].

圖3 接種量對SA小球降解多菌靈的影響Fig.3 Inoculumconcentration influence on carbendazim degradation rate of SA embedded bacteria

圖3 、圖4表明,48h以后,多菌靈降解菌對多菌靈的去除基本不變.SA包埋法的 3種接種量,多菌靈的去除率分別為 74.2%,75.8%和 69.5%.PVA包埋法的3種接種量,多菌靈的去除率分別為 75.5%,78.1%和 77.1%.因此,確定多菌靈去除率最高的2:10為最佳菌接種量.

圖4 接種量對PVA小球降解多菌靈的影響Fig.4 Inoculumconcentration influence on carbendazim degradation rate of PVA embedded bacteria

2.4.4 多菌靈初始濃度對包菌小球降解多菌靈的影響 圖 5顯示,多菌靈濃度為 50mg/L時,多菌靈可完全降解.當多菌靈濃度為100mg/L時,游離菌對多菌靈的降解率為 91%,2種包菌小球的多菌靈降解率維持在 100%.這可能是因為整個降解環境采用無任何碳源的基礎鹽培養基,微生物以多菌靈為唯一碳源,因此可以將多菌靈完全降解.在多菌靈濃度為 300mg/L時,游離菌、SA和 PVA包菌小球對多菌靈的降解率分別為48.3%,56%和 60%.這可能是因為一種高濃度的碳源物質在代謝時,會抑制活性酶系統代謝其他類型的的碳源基質,或者抑制其他碳源代謝途徑中的一種或者幾種關鍵酶的合成[16].

2.4.5 活化時間對包菌小球降解多菌靈的影響 活化時間增加,包菌小球降解多菌靈的效果呈現升高-降低的變化(圖 6).包菌小球的活化時間由 24h增加到 48h,多菌靈的去除率呈上升趨勢.活化24h,SA和PVA去除率分別為71.8%和71.2%;活化時間增加到48h,SA和PVA降解率分別提高到 78.2%和 80.3%.研究結果說明:固定化后的多菌靈降解菌,在 24～48h之間,處于指數生長期.超過48h,由于微生物進入衰亡期,其降解效果大幅降低.因此,確定48h為最佳活化時間.

圖5 初始濃度對包菌小球降解多菌靈的影響Fig.5 The initial concentration influence on carbendazim degradation rate of embedded bacteria

圖6 活化時間對包菌小球降解多菌靈的影響Fig.6 The activation time influence on carbendazim degradation rate of embedded bacteria

3 結論

3.1 本實驗條件下包埋的最適條件為:SA濃度2%、CaCl2濃度4%,交聯24小時;PVA濃度10%、CaCl2濃度3%,交聯24h.培養48h后多菌靈的降解率分別為80.4%和76.3%.

3.2 最適溫度為30℃,SA與PVA包菌小球的多菌靈降解率為 81.5%和 73.3%,比游離菌分別提高了28.1%和15.3%.

3.3 反應體系的最佳pH值為6,SA與PVA包菌小球的多菌靈去除率為 76.8%和 78.9%,比游離菌分別提高了46.3%和50.3%.

3.4 接種量為 2:10時,多菌靈去除率最高,SA PVA包埋的多菌靈去除率分別為 75.8%和78.1%.

3.5 多菌靈濃度100mg/L時,游離菌的降解率為91%;SA與PVA包菌小球可以將其完全降解;增加多菌靈的濃度,降解能力降低.

3.6 在最佳的活化時間(48h),SA與PVA包菌小球的去除率分別為78.2%和80.3%.

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Study on embedding conditions and degradation characteristics of a carbendazim degrading bacteria.

DOU Jing-jing1, FENG Gui-ying2, HU Shi-bin2*, Li Lin3(1. College of Resources and Environment, Northwest Agriculture and Forestry University, Yangling 712100, China; 2. College of Science, Northwest Agriculture and Forestry University,Yangling 712100, China; 3. Water Resources and Hydropower Survey and Design Institute of the Third Engineering Bureau, Xi’an 710016, China). China Environmental Science, 2011,31(3)：431～436

Embedding a carbendazim degrading bacteria with sodium alginate (SA) and polyvinyl alcohol (PVA), the optimal embedding conditions and the efficiency of degradation after embedding were studied. The optimal SA embedding condition is that the bacteria were mixed with 2% SA (1:5) and cross-link in 4% CaCl2for 24h at room temperature. The optimal PVA embedding condition is that the bacteria were mixed with 10% PVA (1:5) and cross-link in 3% CaCl2under the same condition. After 48h activation, at pH6and 30℃, the degradation rate of SA embedding carbendazim degrading bacteria can reach 80.4%, and the degradation rate of PVA embedding bacteria can reach 76.3%.Key words：carbendazim；degrading bacteria；optimization of embedded；degradation

X172

A

1000-6923(2011)03-0431-06

2010-07-26

中央環保專項資金(財建【200】號)

* 責任作者, 教授, hushibin2003@yahoo.com.cn

竇晶晶(1986-),女,河北邢臺人,碩士研究生,主要從事環境微生物的研究.