鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗中通過吸光度值測定菌液濃度的方法研究

周 謖 ，李 睿，朱鴻雁，張志超，方 靜，唐黎明，

(1．上海市食品藥品檢驗所，上海 201203；2．化妝品監測評價重點實驗室，上海 201203)

鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗，也稱作Ames試驗，由Bruce Ames教授于1970年建立[1]。Ames試驗是一個廣泛應用的通過細菌檢測化合物突變性的試驗，通常使用營養缺陷型的鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)。它可以檢測90%的化學致癌物和非致癌物[2]。由于此試驗方便、快捷、檢出率高，因此已被各大實驗室廣泛應用。

Ames試驗中最主要的試驗材料就是過夜培養的菌液，菌液的濃度、活性對試驗的結果影響很大。諸多試驗規范和參考文獻中列出了對菌液濃度的要求為活菌數(1～2)×109個/mL[2-3]，雖然作出了這項規定，但如何獲得此濃度的菌液仍是一個問題，有規范標示37℃、100 r/min培養10 h或37℃靜置16 h即可達到這一濃度[4-5]，但是卻沒有任何試驗證明，且不同實驗室菌液擴增的體系不同、旋轉培養箱的型號不同也會導致不同的結果，即使按上述條件操作也未必能獲得上述濃度的菌液。由于菌液的濃度在一定的范圍內和其吸光度值[D(λ)值，λ為波長數值]呈正比，因此本試驗中，擬尋找出通過吸光度值測定鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗中菌液濃度的方法。

1.1 材料

1.1.1 菌種 營養缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA102購于美國Moltox公司。

1.1.2 試劑 2號營養肉湯培養基購于英國Oxoid公司，瓊脂粉購于美國BD公司，0.9%生理鹽水購于華裕(無錫)制藥有限公司，L-組氨酸和D-生物素購于美國Sigma公司。

1.1.3 儀器 LA2-6AX生物安全柜購于新加坡ESCO公司，BD240恒溫培養箱購于德國Binder公司，Vortex-Genie2漩渦混合器購于美國Scientific Industries公司，INNOVA 40R恒溫培養搖床購于德國Eppendorf公司，數顯恒溫金屬浴購于美國Boekel公司，CKX41SF倒置顯微鏡購于德國Leica公司，Spectra Max Plus384酶標分析儀購于美國Molecular Devices公司。

1.2 方法

1.2.1 測定波長的確定取培養過夜的營養肉湯和菌液，按每孔100μL加入96孔板，每個樣本加8個復孔，用酶標儀測定540和600 nm波長下菌液的吸光度值，選取吸光度值較大的波長數值。

1.2.2 菌液擴增時間取頂層瓊脂500 mL，加熱融化后，加入50 mL組氨酸-生物素，混勻，按每管2 mL分裝，再每管加入0.5 mL PBS，備用。

從-80℃冰箱中取出凍存的菌液，37℃融化后，按每25μL菌液加入5 mL營養肉湯培養基的比例擴增，放入旋轉培養箱，于37℃、100 r/min條件下培養，選取接種后0、2、4、6、8、10、12、14 h共8個時間點，取出菌液，按每孔100μL加入96孔板，每個時間點加8個復孔，同時將培養相同時間的營養肉湯培養基作為本底對照，用酶標儀于540 nm波長下測定D(540)值。

同時取上述8個時間點的菌液，進行平板菌落計數。取每個時間點的菌液1 mL，加入9 mL生理鹽水，混勻，此稀釋倍數為1×101倍；再從此稀釋倍數中吸取菌液1 mL，加入9 mL生理鹽水，混勻，此稀釋倍數為1×102倍；按此10倍稀釋的方法逐步稀釋成1×101～1×1010倍共10個稀釋倍數。每個稀釋倍數取0.1 mL加入已準備好的頂層瓊脂，在振蕩器上混勻，澆入營養肉湯平板，鋪勻。每個稀釋倍數重復制作3皿，待冷凝后，倒置放入培養箱，24 h后選取1×101～1×1010共10個個稀釋倍數中平皿總菌落數在30～300范圍內的平皿進行計數，計算3皿菌落數均值，將菌落數均值乘以稀釋倍數，得到各時間點的菌液濃度。菌液濃度的計算公式為：菌液濃度(個/mL)=菌落數均值×進行菌落計數的稀釋倍數×10。以菌液擴增時間為橫坐標，菌液濃度和D(540)值為縱坐標，繪制菌株生長曲線，確定菌液最佳擴增時間。

1.2.3 菌液D(540)值和平板菌落計數法測定菌液濃度取頂層瓊脂500 mL，加熱融化后，加入50 mL組氨酸-生物素，混勻，按每管2 mL分裝，再每管加入0.5 mL PBS，備用。

根據1.2.2中確定的最佳擴增時間擴增菌液，取擴增好的菌液5 mL，加入5 mL營養肉湯，混勻，此稀釋倍數為1×21倍；再從此稀釋倍數中吸取菌液5 mL，加入5 mL營養肉湯，混勻，此稀釋倍數為1×22倍；按此2倍稀釋的方法逐步稀釋成1×21～1×29倍共9個稀釋倍數；未進行任何稀釋的菌液記為1×20倍(見表1)。取1×20～1×29共10個稀釋倍數的菌液，按每孔100 μL加入96孔板，每個稀釋倍數加8個復孔，同時將培養相同時間的營養肉湯培養基作為本底對照，測定D(540)值。

表1 菌液D(540)值測定和平板菌落計數時的稀釋倍數

取1×20～1×29共10個稀釋倍數的菌液，按1.2.2中的方法進行平板菌落計數(見表1)。以各稀釋倍數的D(540)值為橫坐標，菌液濃度為縱坐標，作散點圖，求回歸方程。

2 結果

2.1 吸光度值測定波長

培養過夜的營養肉湯和菌液在96孔板中分別測定了D(540)值和D(600)值，測得8個復孔的吸光度值見表2。在540 nm下菌液的吸光度值顯著高于600 nm，因此選取吸光度值較大的540 nm進行測定。

表2 營養肉湯和菌液在不同測定波長下的吸光度值

2.2 菌液擴增時間

根據不同擴增時間下的D(540)值-菌液濃度繪制曲線見圖1。菌液的吸光度值基本呈現出了逐漸上升的趨勢，而菌液濃度在培養2 h后迅速升高，約10 h達到最高值，隨后逐漸下降，因此最佳的擴增時間為培養10 h。

圖1 不同擴增時間下的D(540)值和菌液濃度

2.3 菌液D(540)值和菌液濃度測定

菌液在1×20～1×29等10個稀釋倍數測定了吸光度值，8個復孔的D(540)值(扣除營養肉湯的本底值)結果見表3。

表3 菌液D(540)值的測定

根據表3各復孔的D(540)值分別計算1×20～1×29共10個稀釋倍數的D(540)均值，選取1×101～1×1010共10個稀釋倍數中平板菌落數在30～300范圍內的稀釋倍數計算出菌液濃度，結果見表4。

表4 菌液濃度的計算和選擇

以1×20～1×29共10個稀釋倍數的D(540)均值為橫坐標，菌液濃度為縱坐標，作散點圖(見圖2)。設置截距為0后，添加趨勢線，可得直線回歸方程y=4×109x(R2=0.999 6，方程中x為D(540)值，y為菌液濃度，單位為個/mL)。

圖2 D(540)值-菌液濃度圖(第1次)

隨后，按照相同的方法選取了另一株凍存的菌株TA102進行了重復測試，確認直線回歸方程的準確性。選取1×20～1×29共10個稀釋倍數，測得的D(540)值和菌液濃度結果見表5，繪制的D(540)值-菌液濃度圖見圖3。

表5 第2次試驗測定的D(540)值和菌液濃度

圖3 D(540)值-菌液濃度圖(第2次)

根據同樣的方法，可得直線回歸方程y=4×109x(R2=0.992 8，方程中x為D(540)值，y為菌液濃度，單位為個/mL)。

3 討論

由于培養過程中菌液濃度是一個動態變化的過程，因此如何準確的得出所要菌液的濃度一直是一個讓試驗人員頭疼的問題。常用的方法包括比濁法和平皿計數法，但是濁度儀在實驗室中并不普及，而平板菌落計數法需要等24 h后菌落長出方可計數，有一定的時間延遲，故也不方便應用[6]。由于菌液濃度和吸光度值之間存在線性關系，故可以通過吸光度值的測定來判斷菌液濃度。林靜等[7]報道了在600 nm測定5種常見致病菌的吸光度值，段夢奇等[8]發現550 nm比600 nm更適用于百日咳菌液的吸光度值測定，計芬芬等[9]比較了各種波長，認為國內微生物定量細菌一般使用600 nm。對于Ames試驗中所用到的營養缺陷性鼠傷寒沙門氏菌，有的研究人員在540 nm下測定吸光度值，認為D(540)值在0.1～0.2的范圍內可滿足試驗要求[2]，有的研究人員在600 nm下測定吸光度值[10]，因此在本試驗中主要選擇這兩個波長進行了研究，結果發現在540 nm時菌液的吸光度值顯著高于600 nm，因此選擇540 nm測定。

Ames試驗中，菌液的濃度對試驗影響較大，如菌液濃度太低，則會降低試驗的敏感性[10]，如果菌液濃度太高，則細菌的活力會下降。針對本實驗室凍存的營養缺陷型鼠傷寒沙門氏菌，通過接種后連續測定其0～14 h的菌液濃度和D(540)值，發現菌液的濃度變化基本呈現一個“S形”曲線，大約在培養10 h后達到了菌液的最大濃度，雖然此后吸光度值仍在上升，但是活菌數卻在下降，這是由于死亡的菌體也有一定的吸光度值所導致[11]。因此在本試驗中，將接種物放于旋轉培養箱中于37℃、100 r/min培養10 h，即可獲得對數生長末期的菌液。

各規范和文獻均要求菌液濃度為活菌的數目，即CFU(Colony-Forming Units)/mL，通過平板菌落計數法折算出的菌液濃度就是CFU/mL，和業內要求一致。隨后，本研究通過吸光度值測定和平板菌落計數法，建立了菌株TA102菌液濃度和吸光度值的直線回歸方程，兩次試驗的結果均表明菌液濃度和D(540)值之間存在良好的線性關系，可通過直線回歸方程y=4×109x由D(540)值計算獲得菌液濃度。如菌液的D(540)值(扣除營養肉湯的本底值)在0.25～0.50之間即可保證獲得菌液的濃度在(1～2)×109個/mL。2次試驗培養10 h后獲得的菌液濃度分別為7.50×108個/mL和7.47×108個/mL，未達到109個/mL，但是考慮到稀釋時的損耗和2個粘連的菌體只會生長出1個CFU，因此平板稀釋法的結果往往偏低。因此，本擴增條件完全可以滿足(1～2)×109個/mL這個范圍。

在條件相同(同一批次凍存的菌液，相同的接種體系，相同的儀器)時，每次擴增出來的菌液濃度都應相近，即D(540)值相近，每次只需測定菌液的D(540)值(扣除營養肉湯的本底值)是否在0.25～0.50之間即可知道這次擴增的菌液濃度是否在(1～2)×109個/mL范圍內。如D(540)值太低，則表明生長狀態不好，菌液濃度不足，無法進行試驗；如D(540)值太高，則表明可能產生污染，也無法進行試驗。通過TA102菌液擴增條件的摸索和確定，證明通過測定菌液吸光度值可對菌液濃度進行預測和質量控制，此法科學、簡單、快捷。