硫唑嘌呤在胰腺癌動物模型制作中的應用*

吳介恒，盧興兵，李榮妍，呂智慧，黃莎圓子，劉夢娜，郭素紅

(吉林醫藥學院檢驗學院，吉林吉林 132013)

胰腺癌是一種惡性程度很高且以早期轉移為突出特征的腫瘤,其發病率在近年呈逐年上升趨勢。臨床上尚無經濟、有效的早期發現方法[1-2]。 而造模是研究胰腺癌的基礎，因此建立合適的人胰腺癌動物模型對胰腺癌的治療研究起著十分重要的作用[3]。但目前仍沒有一種完全可行的胰腺癌動物模型的制作方法。本文通過對SD雄性大鼠每天灌服硫唑嘌呤(AZA)，皮下移植胰腺癌細胞的方法，來尋找最適合成瘤的AZA濃度，從而建立一種成瘤率高、操作簡單方便的胰腺癌造模方法。

1 材料與方法

1.1材料 (1)實驗動物及細胞株：清潔級，雄性SD大鼠40只，體質量 180～200 g，購自吉林大學動物實驗中心；Mia PACAⅡ胰腺癌細胞株由吉林醫藥學院檢驗學院饋贈。(2)實驗用品：DMEM低糖培養基、0.25%胰酶-EDTA購自Gibco公司；新生胎牛血清購自杭州四季青公司；大鼠CA24-2 ELISA 96T試劑盒購自美國R&D公司；一次性真空采血管(EDTA-K2抗凝)購自湖南瀏陽三力集團；CO2培養箱、倒置顯微鏡、血細胞計數板、微量天平由吉林醫藥學院檢驗學院提供。(3)AZA：購自上海醫藥(集團)有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 將剛復蘇的Mia PACAⅡ胰腺癌細胞接種在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及0.1 mg/mL鏈霉素的DMEM低糖培養基中，培養于37 ℃、5%CO2培養箱中，平均每3～4 d傳代1次處于對數生長期Mia PACAⅡ細胞見封2圖1。

1.2.2動物實驗分組 采用完全隨機化設計的原則，按照AZA的濃度梯度對所購買的40只SD大鼠進行分組：空白對照組(A組)、2.6 mg/kg AZA組(B組)、2.2 mg/kg AZA組(C組)、1.8 mg/kg AZA組(D組)、1.4 mg/kg AZA組(E組)，每組8只。A組每天灌服2 mL生理鹽水，B、C、D、E組每天灌服相應濃度的AZA生理鹽水液2 mL。

1.2.3移植實驗 在大鼠灌胃30 d后 ，將處于對數生長期的Mia PACAⅡ細胞，用0.25%胰酶-EDTA消化，用非完全培養基制成細胞懸液，用血細胞計數板對細胞進行計數，制成細胞密度為3×105個/0.2 mL的細胞懸液，用乙醚麻醉大鼠后，于大鼠右側腋窩處，皮下移植0.2 mL Mia PACAⅡ細胞懸液。

1.2.4指標檢測 在移植后第15、 20、 25、30天采集大鼠血漿進行CA24-2檢測，CA24-2檢測采用由美國R&D公司生產的生物素-親和素酶聯免疫吸附試驗(BSA-ELISA)中直接BA法進行檢測，然后用DNM-9602型酶標儀，在450 nm波長處檢測各孔光密度(OD)值，通過標準曲線進行換算。

1.2.5大鼠狀態觀察 移植細胞后，每天對SD大鼠飲食和活動狀態進行觀察。

1.2.6病理檢查 在移植后的第30天斷頸處死大鼠，取出其胰腺組織和腋窩下淋巴結，置于4%多聚甲醛中固定，然后用HE染色并制成石蠟切片，在顯微鏡下觀察。

2 結 果

2.1大鼠一般狀況觀察 在移植Mia PACAⅡ細胞細胞懸液后，各組大鼠的活動減少、進食減少，質量減輕；在移植細胞后的第15天，大鼠質量、進食、活動進一步下降，在給藥的第30天，B、C、D、E組各有2只SD大鼠死亡。

2.2CA24-2檢測 通過對各組大鼠體內CA24-2檢測發現，B、C、D、E組均為陽性結果，在移植后的第15、20、25、30天B組大鼠體內CA24-2水平分別為(51.56±2.14)、(51.61±1.21)、(54.66±1.02)、(56.00±0.38)U/mL，與C、D、E組相對應的移植時間比較，差異有統計學意義(P<0.05)；B、C、D、E組在移植后第15、20、25、30天大鼠體內CA24-2的含量與A組(3.35±0.38)U/mL比較，差異有統計學意義(P<0.05)；隨著移植時間的增加，B、C、D組大鼠體內CA24-2水平差異有統計學意義(P<0.05)；E組在移植后第15、20、25、30天時，大鼠體內CA24-2的水平差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血漿中CA24-2水平比較(U/mL)

2.3病理學檢查 在高倍視野下觀察發現，胰腺組織的正常結構消失，被纖維組織替代，腫瘤細胞呈彌漫狀分布，腫瘤細胞排列均勻。在油鏡下觀察發現，細胞形態大小不等且畸形，細胞核大，核深染，可見1～2個核仁及雙核(封2圖2～6)。其中，B組有5只、C組有3只、D組有2只、E組有1只大鼠有上述改變，A組無任何異常變化，見封2圖7。

2.4各組大鼠成瘤率比較 B組成瘤率為83.3%(5/6)， 3只出現腋窩下單個淋巴結和胰腺周圍淋巴結轉移；C組成瘤率為50.0%(3/6)；D組成瘤率為33.3%(2/6)； E組成瘤率為16.7%(1/6)。

3 討 論

腫瘤動物模型是研究腫瘤的前提，理想的腫瘤動物模型應該包含以下內容:(1)致癌的方法簡單易行；(2)經濟快速；(3)指標客觀明確；(4)對癌變器官的特異性高；(5)重復性好；(6)誘發腫瘤的病理類型、生物學行為、電鏡下表現及組織化學改變與人體腫瘤相似[4]。從 20世紀 70年代用化學方法誘導制作出胰腺癌動物模型以來,經過數十年的發展,各國學者又設計出了多種制作胰腺癌動物模型的方法，包括手術方法、同位移植、異位移植和基因工程等方法[5]。但目前這些造模方法都存在一定的缺點，手術造模的方法，大鼠成瘤周期長、成瘤率低，且在手術操作和麻醉中均會造成大鼠不必要的死亡。Clapper等[6]利用敘利亞倉鼠腹腔內注入致癌劑,但同時伴發了胃癌和肝癌。因此,化學物質誘導的方法造出的胰腺癌模型，其特異性不高。此外，目前移植造模大多采用裸鼠，但由于裸鼠飼養條件要求高，同時造模實驗成本較高，故難以得到普遍利用[6]。由于皮下移植瘤模型具有操作簡單，成瘤時間短，腫瘤生長速度快等特點[7]，同時，AZA為免疫抑制劑，能抑制體內T淋巴細胞和B淋巴細胞的生物學功能，對大鼠成瘤有一定的促進作用[8]。因此，本實驗采用對大鼠每天灌服AZA和皮下移植胰腺癌細胞的方法進行大鼠胰腺癌模型的制作。

目前，臨床上常用于診斷胰腺癌的腫瘤標記物指標有：CA24-2、CA19-9，但隨著CA19-9檢測的廣泛開展,發現其特異性正在下降,一些非胰腺癌性疾病也存在CA19-9顯著升高,常致臨床診斷的誤導[9]。CA24-2是一種糖類抗原[10],在胃腸及胰腺廣泛存在,它可補充CA19-9的不足[9]，CA24-2在胰腺癌預后判斷中比CA19-9可能更具價值[11]。此外，病理切片是診斷疾病的主要手段之一[12]。因此，本實驗采用對大鼠體內CA24-2水平檢測和胰腺組織病理切片的觀察來判斷SD大鼠是否成瘤。通過計算各組SD大鼠胰腺癌成瘤率，成功篩選出最適合大鼠成瘤的AZA濃度。當AZA濃度為2.6 mg/kg時，成瘤率最高，為83.3%。

另外，實驗中可能會出現一些干擾因素，而影響SD大鼠成瘤，本研究認為：(1)應盡量選用雄性大鼠， 因為雌鼠體內存在雌激素，雌激素具有免疫增強的作用[13]。(2)Mia PACAⅡ細胞在傳代過程中，用胰蛋白酶消化的時間不宜過長，否則將影響移植的成功率。(3)應該選擇狀態好，處于對數生長期的細胞用于移植[14]，同時，在培養中應避免污染的發生[15]。(4)移植的部位最好選擇在前肢皮下，這樣可以避免其他大鼠碰觸移植部位。

綜上所述，本實驗采用灌服免疫抑制劑和皮下接種細胞懸液的方法構建大鼠胰腺癌動物模型。該種方法具有操作簡便、成瘤時間短、成瘤率高、實驗成本低等優點，

是較為理想和實用的胰腺癌動物模型，該造模方法為后續進行胰腺癌發病機制及治療研究等實驗提供了良好的平臺。

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