不同低氧分壓對SD大鼠骨髓間充質干細胞增殖分化的影響*

彭 濤，黃 姣，徐 凌

(1.重慶市黔江中心醫院口腔科 409000；2.重慶市口腔疾病與生物醫學研究中心/重慶醫科大學附屬口腔醫院牙周黏膜科 401147；3.重慶市口腔疾病與生物醫學研究中心/重慶醫科大學附屬口腔醫院修復科 401147)

骨髓間充質干細胞(bone marrow stromal cells，MSCs)，由于其特有的成骨分化潛能，因而在骨組織工程領域中備受關注[1-2]。但是在組織工程實際應用中，做為種子細胞移植入缺損處后，因為沒有血管化的同步形成，最初處于一相對低氧環境中，因此研究MSCs的增殖和分化是否受缺氧或低氧環境影響具有重要的意義。近年有研究也發現，間充質源性細胞均屬于氧感應細胞。本實驗通過建立低氧-細胞培養模型，探討不同低氧分壓微環境對MSCs增殖及成骨向分化的影響，為后續的進一步研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1主要材料與儀器 (1)主要材料：α-MEM培養基(Gibco，美國)，胰蛋白酶、EDTA、牛血清清蛋白(BSA)，考馬斯亮藍(Sigma，美國)，胎牛血清(Hyclone，美國)，MTT試劑(Gibco，美國)，二甲基亞砜(分析純，中國)，兔抗鼠SH3、CD34、CD44、CD54、CD105抗體，兔抗鼠Ⅰ型膠原蛋白(COLⅠ)抗體，生物素化山羊抗兔抗體(BOSTER，中國)，DAB(北京中杉金橋生物技術公司，中國)。(2)主要儀器：25 cm2培養瓶、6孔培養板、96孔培養板(Corning，美國)；CO2孵育箱(Sanyo，日本)、Heraeus三氣細胞培養箱(Pierce，德國)、倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)、堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒(北京柏定生物工程有限公司)、Leica顯微鏡(德國)、圖像分析系統Image-Pro Plus 4.5(Media，美國)、HTS7000plus多孔板高效分析儀(PE，美國)。

1.2方法

1.2.1細胞來源和培養 取雄性4周齡SD大鼠，引頸法處死，無菌條件下取大鼠股骨，切除兩側的股骨端，用針管吸取5 mL含10%胎牛血清的α-MEM培養基，沖出骨髓，將其接種于25 cm2培養瓶中，用巴氏吸管吹散細胞，然后置于5%CO2、37 ℃、飽和濕度條件的CO2培養箱中靜置培養。第7天換液，棄懸浮細胞。以后每3～4天換液1次，待原代細胞生長融合達到80%以上進行傳代培養，取第4代細胞作為實驗細胞。進行免疫熒光染色，證實獲得SH3+、CD34-、CD44+、CD54+和CD105+的單核細胞為MSCs。

1.2.2不同低氧分壓下MSCs細胞增殖率的MTT法檢測 實驗分為低氧組和常氧組(21%)，低氧組再分2%、4%、6%、8%氧分壓組(分別為低氧1組、低氧2組、低氧3組、低氧4組)。取第4代MSCs消化后，用含10%胎牛血清α-MEM培養基配制成4×104個/mL的細胞懸液。將細胞接種于96孔板中，每孔加入200 μL細胞懸液，每組每個時間點設5個復孔。按照分組情況，將實驗組細胞放置于預先設置好氧分壓的三氣培養箱中，常氧組細胞放置于5%CO2孵箱中靜置培養。3～4天換液1次。在1、3、5、7、9 d 5個時間點，取出96孔板，采取MTT法，用酶聯免疫檢測儀在490 nm波長下測定其調零后的光吸收度值(OD值)。

1.2.3不同低氧分壓下MSCs細胞ALP活性檢測 實驗分組同1.2.2。取第4代MSCs消化后，配制成1×105個/mL的細胞懸液，接種于25 cm2培養瓶里，每瓶加入2 mL細胞懸液，每組每個時間點設3個復瓶。按照分組情況，將實驗組細胞放置于預先設置好氧分壓的三氣培養箱中，常氧組細胞放置于5%CO2孵箱中靜置培養。3～4天換液1次。在1、3、5、7、9 d 5個時間點收集需要檢測的細胞，待樣品全部收集完成后送檢。送檢前，反復凍融3次，形成凍融液。按試劑使用說明處理收集的樣本，用酶聯免疫檢測儀在405 nm波長下測定其OD值，再乘以系數1 383求出樣本中ALP活力(U/L)。同時相同辦法計算出細胞內總蛋白含量(mg/mL)。最后計算單位蛋白含量的相對ALP活性，計算公式為：

1.2.4不同低氧分壓下MSCs細胞COLⅠ的檢測 實驗分組同1.2.2。取第4代MSCs消化后，配制成1×105個/mL的細胞懸液。將細胞接種于6孔板中的玻璃片上，每張加入1 mL細胞懸液，每組每個時間點設5張復片。按照分組情況，將實驗組細胞放置于預先設置好氧分壓的三氣培養箱中，常氧組細胞放置于5%CO2孵箱中靜置培養。3～4天換液1次。在1、3、5、7、9 d 5個時間點，取出6孔板，采用streptavidin biotin-peroxidase complex method(SABC法)對MSCs進行免疫細胞化學染色。第一抗體為COLⅠ兔抗鼠多克隆抗體，第二抗體為鏈酶親和素化山羊抗兔IgG。設置陰性對照(用PBS液代替一抗，其余條件不變)。采用圖像分析系統對染色切片進行檢測。在200倍顯微鏡下將每張切片按系統抽樣法隨機選擇4個視野測定棕黃色陽性顆粒的總面積及平均透光度。然后，通過計算平均積分光密度值(integrated optical density，IOD值)得出陽性染色強度，試算公式為：

平均IOD值=平均透光度×平均陽性面積 (2)

2 結 果

2.1MTT法檢測MSCs細胞增殖率結果 MSCs在低氧微環境中生長時，OD值均較其在常氧微環境中生長的OD值高，其中低氧2組最明顯。在第1、3天各低氧組的OD值變化幅度較小，至第5天各組的OD值變化幅度開始增加，第7、9天各低氧組OD值增加明顯，而常氧組OD值增加較平緩。各低氧組的OD值與常氧組比較，在第5、7、9天均差異有統計學意義(P<0.05)，顯示低氧微環境能促進MSCs的增殖活性。其中，在4%氧分壓為微環境中，MSCs增殖活動最為活躍，但與其他各低氧組比較其OD值差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2MSCs細胞ALP活性定量檢測結果 培養第1天時各低氧組與常氧組的MSCs細胞內ALP表達活性均較弱，隨著培養時間的延長，各低氧組與常氧組MSCs細胞內ALP表達活性逐漸增強，常氧組的ALP表達活性變化幅度較大，而各低氧組升高較平緩。第3、5、7、9天時各低氧組與常氧組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；在各個低氧組內，第7、9天時低氧1組與低氧4組間差異有統計學意義((P<0.05)，見表2。

表1 各低氧組與常氧組MSCs細胞的OD值比較

表2 各組 MSCs細胞 ALP活性比較

表3 各組MSCs細胞內COLⅠ的IOD值比較

2.3各組MSCs細胞COLⅠ免疫細胞化學染色結果 各低氧組MSCs細胞內COLⅠ表達均較弱，常氧組COLⅠ表達相對較強。隨著時間延長，各低氧組MSCs細胞內COLⅠ增加較平緩，常氧組COLⅠ表達變化幅度相對較大。第7、9天時各低氧組與常氧組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；但各時間點各低氧組內的差異均無統計學意義(P>0.05)，見表3。

3 討 論

在骨組織工程學應用上，通常采用的方法是從體內獲得一定數量的種子細胞，然后在體外進行擴增，之后將其附于一生物相容性以及力學性能良好的支架材料上，移植入體內相應組織缺損處進行修復[1-3]。但是，以往通常忽略了一個這樣的問題，在體外擴增時，細胞處于一個常氧(21%)狀態之下，而移植入體內組織缺損處后，因為缺損組織血管化過程需要一定時間，所以種子細胞一開始是處于一個相對低氧的微環境中，以后隨著血管化的逐漸形成，微環境的氧分壓逐漸回升，但就骨組織而言，始終無法達到21%氧分壓的環境中[4-7]。因此，常常在體外實驗中研究種子細胞(如MSCs)的增殖以及成骨向分化的生物學行為，這與將種子細胞置于低氧微環境中生長時的生物學行為相比，可能會有很大的出入。而研究低氧微環境下種子細胞增殖、成骨向分化的生物學行為，對于以后的相關實驗動物研究以及臨床應用更有實際意義。因此本課題以此為出發點，設計研究MSCs在2%、4%、6%、8%、21%氧分壓環境下的增殖活性以及成骨向分化能力，為將其作為種子細胞應用于牙周骨組織工程學上提供實驗依據。

對于實驗所選擇的氧分壓，本課題盡量模擬種子細胞移植入骨缺損處所經歷的一個氧分壓變化。但是這個影響因素很多，如骨缺損的大小勢必會影響細胞所處的氧環境，缺損較大，相應組織血管化就會減慢，多數細胞會較長時間處于低氧環境中，反之，缺損小，組織血管化進程快，血管化面積大，相應細胞就會處于一較高氧分壓的環境中；而且移植處組織的血流受阻情況也存在各種差異，這些也會影響到移植種子細胞所處的氧環境。有研究表明，骨髓組織為一相對缺氧組織，其氧分壓范圍為1%～7%。本課題選擇了氧分壓為2%、4%、6%、8%、21%作為細胞生長的微環境，一方面希望選擇的這個范圍能盡可能真實反映種子細胞移植到缺損處所經歷的一個氧分壓變化范圍；另一方面也希望通過這幾個氧分壓的選擇，能研究出MSCs在不同氧分壓下生物學行為的一個變化規律，為以后的進一步研究提供實驗依據。

本實驗中采取MTT比色試驗用于檢測細胞的增殖率。MTT法的檢測原理是活細胞線粒體內的琥珀酸脫氫酶能夠使外源性的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑嗅鹽(商品名噻唑藍，簡稱MTT)還原為難溶性的藍紫色結晶物甲臜，沉積在細胞中，用二甲基亞砜溶解細胞中的甲臜，最后用酶聯免疫檢測儀在490 nm波長處測定其OD值，因為MTT結晶物形成的量與細胞數成正比關系，所以該檢測方法可以間接反映活細胞的數量。本實驗中MTT法檢測結果顯示，各低氧組對MSCs的增殖活性有明顯的促進作用，在4%氧分壓時，其促進作用最為明顯。這與國外有關研究結果一致，即低氧環境促進MSCs的增殖[6，8-10]。從細胞增殖活性上看，低氧預處理的MSCs細胞作為種子細胞是相當有利的。但是，也要考慮到的就是MSCs細胞處于低氧環境下的分化情況，特別是成骨向分化的情況，這也是本研究選用其作為種子細胞的重要原因。

眾所周知，成骨細胞早期分化的指標之一就是ALP活性的增加。ALP可以水解有機磷酸酯，進而釋放出磷酸鹽，使得游離的磷酸鹽與鈣發生結合，形成磷酸鈣，磷酸鈣再沉積在細胞周圍基質的膠原中，最終形成了新生骨。眾多實驗證實，沒有ALP的生成，骨組織鈣化就不會發生。從骨組織結構來看，是由2/3的無機物和1/3的有機物構成，其中COLⅠ就占到了有機物中的80%～90%，對骨組織結構的完整、、生物力學的維持起著重要的作用。COLⅠ構成骨組織的框架，其合成和分泌是骨組織形成的前提條件，加速它的合成分泌，可以明顯促進骨組織的礦化進程。因此，本實驗選取ALP和COLⅠ作為檢測指標，用于觀察MSCs細胞在不同低氧分壓下成骨向分化的情況。從本實驗的數據可以看出，低氧微環境抑制MSCs細胞ALP活性和細胞內COLⅠ的表達，也抑制MSCs細胞成骨向分化，而且這種抑制作用與氧分壓有關，氧分壓越低其抑制作用越明顯。這與有關研究結果一致，即認為低氧環境抑制MSCs內ALP以及COLⅠ的表達，抑制MSCs成骨向分化[11-13]。 但也有研究卻認為低氧環境能促進MSCs內ALP以及COLⅠ的表達[14-15]。其研究結果的差異性可能為細胞模型不同，或培養條件不同所造成。

以上實驗說明在運用組織工程學方法修復牙周骨缺損中，通過低氧預處理的MSCs細胞僅能增加其增殖活性但不利于MSCs細胞ALP活性和COLⅠ的表達，也極不利于MSCs細胞的成骨向分化。以后的研究應該進一步明確其抑制成骨向分化的作用機制，以期在體外細胞培養中加以干預，使其移植入缺損后更有利于骨組織的形成。

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