蛋白質組學主要技術及在腫瘤診斷中的應用

?，摤?姜蘭香 (吉林大學第二醫院皮膚科，吉林 長春 130041)

目前隨著人類基因序列破譯相繼完成〔1〕，蛋白質組研究已成為目前生命科學發展中不可或缺的一部分。相同基因在不同條件、不同時期可能會引起完全不同的作用，加上翻譯后修飾作用如磷酸化、糖基化、乙?；?、羥基化以及蛋白質自剪接等，都會使蛋白質的結構功能發生變異。蛋白質的變異與疾病的發生關系最為密切，通過對正常及病理個體之間的蛋白質組的比較和分析，從中找出某些疾病的特異性蛋白質分子，可能成為疾病尤其是腫瘤的早期診斷的分子標志。

蛋白質組學技術應用到腫瘤生物學的研究中，以尋找腫瘤標志物為目的，以蛋白質組學方法為手段，結合腫瘤分子機制的基礎研究與腫瘤檢測、診斷等臨床研究，最終產生出能應用于臨床的腫瘤檢測和治療的蛋白質靶標。腫瘤蛋白質組學經歷了表達譜、修飾譜到活性譜的進化過程，在不同的層面上揭示腫瘤可能的致病機制。本文概述了近年來在常見的惡性腫瘤中進行的腫瘤蛋白質組學研究，應用各種蛋白質組學技術方法，找到了大量的蛋白質標志物。

1 蛋白質組學概念

蛋白質組是指細胞、組織或基因組所表達的全部蛋白質，蛋白質組學是運用各種技術手段分析細胞內動態變化的蛋白質組成成分、表達水平和修飾狀態，了解蛋白質之間的相互作用與聯系，揭示蛋白質功能與細胞生命活動規律〔2〕。

2 蛋白質組學研究的核心技術

目前蛋白質組技術主要涉及雙向電泳(2-DE)及質譜(MS)技術對蛋白進行分離、分析及鑒定〔3〕。細胞蛋白質通過高分辨率的雙向凝膠電泳的圖譜時經掃描儀掃描并使之數字化，運用二維分析軟件對數字化的圖譜進行各種圖像分析。一種細胞或組織的蛋白質組經雙向電泳后可分離到幾千甚至上萬種蛋白質，尚需質譜技術去鑒定。從質譜技術測得的完整蛋白相對分子質量、蛋白質的肽質譜(或稱肽質譜指紋，peptide mass fingerprint)以及部分肽序列等數據通過相應數據庫的搜尋來鑒定蛋白質。在蛋白質定性和定量分析的基礎上，建立蛋白質數據庫。

2.1 2-DE 基本原理是根據蛋白質的等電點的差異而使之進行第一相等電聚焦(IEF)，然后按照其相對分子質量大小進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)第二相電泳分離，使相同等電點的蛋白質得以分離。

2.2 MS技術 MS技術的原理是根據蛋白質生化特性不同，選擇性地從待測生物樣品中捕獲配體，將其結合在芯片的固相基質表面上，利用激光脈沖輻射使芯片表面的分析物解析成帶電離子，質荷比不同的離子在電場中飛行時間不同，據此繪制出質譜圖。結合蛋白質數據庫檢索可實現對蛋白質的快速鑒定和高通量篩選。

2.3 生物信息 在蛋白質組分析的各個水平都需要生物信息工具。隨著2-DE、MS等技術的發展，實驗檢測中產生的信息量將越來越大。單靠人工去分析處理是不可能完成的，現在已有眾多的軟件應用于2-DE進行圖像掃描、剪輯、對比，如2-DE Analysis Software等。2-DE所得到的大量蛋白質組圖譜，以及MS分析得到的蛋白質的物理、化學、生理、病理數據都可以通過互聯網查詢。目前swiss prot和TrEMBL蛋白質數據庫已成為重要的蛋白質組數據資源。有利于研究者分析已鑒別的蛋白質的轉錄后修飾三維結構、生化特性等。另外肽MS結合環境參數，如等電點、相對分子質量、化學修飾等可在Swiss prot和TrEMBL等蛋白質數據庫中尋找可與其匹配的蛋白質序列。

3 蛋白質組學技術在腫瘤診斷中的應用

在腫瘤發病過程中，大多數學者認為基因和環境都起著關鍵性的作用?，F已證明許多蛋白質在腫瘤皮損中均表達異常，這與腫瘤的發病相關。這些蛋白質主要是一些小分子蛋白質及磷酸化異常的蛋白質。通過2-DE方法分離正常皮膚、腫瘤的蛋白質混合物，經染色和分析軟件的處理得到差異蛋白質點，對這些蛋白質點用MS技術分析和數據庫搜索鑒定出該蛋白質。這些蛋白質即可成為腫瘤早期診斷的分子標志。

3.1 在肺癌診斷中的應用 Chen等〔4〕運用2-DE聯合MS鑒定技術，通過對93例肺腺癌組織和10例正常組織的蛋白質組學對比研究，發現了抗氧化酶 AOE372、ATP合酶亞基 d(ATP5D)、β1，4半乳糖轉移酶、胞漿無機化焦磷酸酶、糖調節Mr58000蛋白、谷胱苷肽S轉移酶M4、脯氨酰4羥化酶β亞基、磷酸丙糖異構酶以及反巰基酯酶(UCHL1)等9個肺腺癌潛在標志物。Okano等〔5〕則聯合多維液相色譜與2-DE技術，對5例肺癌患者的血漿在去除高豐度蛋白后行蛋白組學的分析，并與4例正常對照，發現包括α-1-酸糖蛋白、視黃醇結合蛋白、叢生蛋白及肌動蛋白等58種基因表達產物在兩者血漿中存在著差異表達。

3.2 在乳腺癌診斷中的應用 Vercoutter-Edouart等〔6〕發現在35個癌變組織中，14-3-3σ在人類乳腺癌細胞中表達量都下調了約10倍，而14-3-3α，β，δ，ζ，的量沒有明顯的變化。從而說明在癌變過程中僅14-3-3σ在起作用，因此14-3-3σ可以作為診斷乳腺癌的潛在分子靶標。Page等〔7〕從封閉期人類乳腺中分離純化出乳腺管腔細胞和肌上皮細胞，然后提取乳腺癌患者與正常人的這兩種細胞的蛋白質，經2-DE技術分離，MS鑒定出了51個具有兩倍或兩倍以上差異的蛋白質，其中包括cytokeratin 5、17、19;annexin II;熱休克蛋白 60、27 等。這些差異蛋白都有望成為生物分子靶標。

3.3 在卵巢癌診斷中的應用 Morita等〔8〕利用差異熒光顯示凝膠電泳和MS分析技術對卵巢癌細胞系OVISE，OVTOKO和MCAS相關蛋白質群進行了鑒定，共檢測到18個上調和31個下調的蛋白質點，它們在兩個卵巢透明細胞癌(CCA)細胞系和對照MCAS細胞系中的表達至少有兩倍的差異。隨后使用來自CCA病人的外科樣品進行驗證，結果發現上述鑒別出的差異蛋白質在真實組織中的表達確有差異，與其在CCA培養細胞中表達水平一致;表明蛋白質組學方法能夠鑒定不同組織類型的卵巢癌相關蛋白，這些蛋白質有可能成為不同組織類型的卵巢癌如CCA的診斷標記物和治療靶標。

3.4 在肝癌診斷中的應用 Zinkin等〔9〕應用MS技術鑒別出一些肝癌患者血清的腫瘤標志，比較其與甲胎蛋白(AFP)、糖化AFP-L3片段以及PIVKA2的敏感性和特異性，41個丙型肝炎病毒(HCV)感染相關肝癌病人和51個HCV感染的肝硬化病人做比較，發現11個蛋白質高峰，其中包括半胱氨酸蛋白酶抑制劑C，這些腫瘤標志診斷的敏感性和特異性分別是79%和86%。與其他腫瘤標志相比，主要是能鑒別出小于2 cm的腫瘤，表明蛋白質組學方法鑒別出的標志易于區分HCV感染相關的肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)小腫瘤。許多相關研究鑒別和篩選出了一些血清肝癌標志，如富含亮氨酸的A2 AFP和A1抗胰蛋白酶、熱休克蛋白27、補體C3a、載脂蛋白A1前體、血清淀粉樣蛋白A、嗜中性激活肽等〔10〕。這對肝癌的早期監測有重要的指導意義。

3.5 在膀胱癌診斷中的應用 鈣網素(CRT)的一般生物學特性：CRT是一種內質網的分子伴侶，是首先在四肢肌肉細胞肌質網中發現的一種鈣結合蛋白，后來在非肌肉細胞中也有發現。據報道〔11～13〕，CRT并不特異地存在于膀胱癌。在非膀胱癌患者的尿路感染人群中有極高的陽性率(88%)。因此用CRT診斷膀胱癌需排除尿路感染。此外CRT在其他各種腫瘤中也存在。在鄰近尿路的泌尿系腫瘤包括腎細胞癌、前列腺癌也發現CRT，但它們的陽性率比膀胱癌低。乳腺癌患者乳腺組織與正常組織相比CRT升高，但尿液CRT陽性率比膀胱癌低得多，根據多數學者推測只有有活力的腫瘤細胞才能分泌CRT入尿。對早期檢測膀胱癌起重要的指導意義。

3.6 在前列腺癌診斷中的應用 血清前列腺特異抗原(PSA)作為最有價值的腫瘤標志物廣泛應用于前列腺癌的診斷、療效評價和預后判斷，使前列腺癌的診治效果得到了很大的提高。然而PSA畢竟是一個組織特異性而非腫瘤特異性的標志物，受諸多因素影響，在某些疾病特定狀態下缺乏足夠的敏感性和特異性，所以，當PSA被廣泛應用于前列腺癌的篩選、診斷及預后判斷時，出現敏感性差和特異性低的現象也就可以理解了〔14〕。Zheng等〔15〕利用SELD-I技術，分析了22例前列腺癌根治術切除標本，發現了一個特殊蛋白Pca224，其平均分子質量為(24 782 156±107 127)m/z，并應用激光捕獲微解剖技術(LCM)，進一步證實了Pca224蛋白來源于前列腺癌細胞。Pan等〔16〕采用SELD-I蛋白質芯片技術分析了83例前列腺癌病人和95例正常對照者血清樣本，發現了18個血清差異蛋白峰，其中4個蛋白峰在前列腺癌病人血清中水平升高，14個蛋白峰在前列腺癌病人血清中水平下降，選取8個標志蛋白用于建立前列腺癌診斷的分類樹模型，得到4層分類樹，利用統計學分析軟件，診斷的敏感性達到92%，特異性達到96.7%，研究表明這是一項有前途的早期診斷前列腺癌準確率高且無創的方法。

3.7 在惡性黑素瘤診斷中的應用 高天文等〔17〕通過激光共聚焦顯示Foxp3分子定位于黑素瘤細胞的胞核和核周部位。黑素瘤組織病理切片的免疫組織化學證實Foxp3表達于黑素瘤細胞的胞核和核周，皮內痣的黑素瘤細胞未檢測到Foxp3的表達，最后得出結論：黑素瘤細胞系及黑素瘤組織中的黑素瘤細胞普遍存在于Fopx3的表達，而原代培養和皮內痣組織中的黑素瘤細胞未檢測到Fopx3的表達。

4 展望

隨著現代生物信息學的飛速發展，必將在蛋白質組時代發揮更大更重要的作用。目前，蛋白質組學技術廣泛應用于各種生命科學包括細胞生物學、神經生物等學科在臨床研究中，2-DE聯合MS技術已在多種腫瘤研究中展開，隨著研究的不斷深入和技術的不斷革新，相信在不久的將來，通過各種蛋白質組學的各項技術能發掘出更新、更多的腫瘤標志物，進一步揭開腫瘤的發生、轉移及耐藥機制，為腫瘤特別是惡性腫瘤的早期診斷、靶向治療和新藥開發將提供重要的理論基礎。

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