大孔樹脂純化紫花地丁中γ-氨基丁酸的研究

黃美娥，董愛文，郭小玲，林永慧

(1.吉首大學林產化工工程湖南省重點實驗室，湖南張家界427000;2.吉首大學生物資源與環境學院，湖南吉首416000)

紫花地丁Viola yedoensisMakino，又名光萼堇菜、地丁菜等，為堇菜科堇菜屬植物［1-2］，是我國傳統中藥材，其野生資源豐富。紫花地丁中含有大量生物活性成分［2-9］，其中γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid)是一種重要的功能性非蛋白組成氨基酸，參與體內的多種代謝活動，具有很高的生理活性，γ-氨基丁酸在醫藥、食品、飼料中具有廣闊的應用前景，2009年9月29日已被中華人民共和國衛生部批準為可用于食品生產加工的新資源。開發γ-氨基丁酸產品及其功能性食品、保健品是當前食品及醫藥領域的研究熱點之一。本實驗擬采用大孔樹脂法分離純化紫花地丁中γ-氨基丁酸，提高其含有量，為進一步開發紫花地丁資源奠定基礎。

大孔樹脂具有高效、低毒的特點，被廣泛應用于中藥材活性成分的提取純化。本實驗首次采用大孔樹脂法對紫花地丁中γ-氨基丁酸進行純化，比較7種不同型號樹脂吸附特性，篩選出最佳樹脂?？疾炝松蠘淤|量濃度、洗脫劑用量、洗脫劑體積流量等工藝參數，確定了最佳純化工藝條件。

1 材料與儀器

紫花地丁鮮樣采于湖南省張家界市沙堤紫花地丁種植基地，將其洗凈后瀝干，置恒溫干燥箱中50℃干燥，粉碎過篩，密封保存備用。

γ-氨基丁酸對照品SIGMA公司，批號BCBC3246V;乙醇、苯酚、硼酸、硼砂、氫氧化鈉等均為分析純;D941、LX—17樹脂由西安藍曉科技有限公司提供;SA—2、732、001×16、AB—8、330樹脂由安徽三星樹脂科技有限公司提供。AEG—220分析天平，日本SHIMADZU公司;UV757紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司;R—215旋轉蒸發儀瑞士BUCH公司。

2 方法與結果

2.1 γ-氨基丁酸的測定

2.1.1 對照品溶液的配制取γ-氨基丁酸對照品50.0 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，用60%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成1.0 mg/mL的對照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備稱取紫花地丁樣品粉末1 kg，加15倍量60%乙醇溶液于40℃浸提2 h，過濾;重提一次，合并濾液，減壓濃縮，備用。

2.1.3 檢測波長的確定取對照品溶液于紫外分光光度計上，自200～800 nm范圍內自動掃描，γ-氨基丁酸溶液在600～700 nm區間有很強的吸收，最大吸收波長為644 nm，故選擇644 nm作為測定波長。

2.1.4 標準曲線的繪制分別吸取1.0 mg/mL對照品溶液0、2、4、6、8、10 mL至10 mL量瓶中，定容至刻度，配成0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/m L的對照品溶液。分別吸取0.0、0.2、0.4、0.8、1.0 mg/mL γ-氨基丁酸對照品溶液600 μL，加入硼酸緩沖液(pH9.0)400 μL，6%重蒸酚1 000 μL，混勻，再加入5%NaClO溶液混勻，沸水水浴10 min，冰水冷卻20 min，加入60%乙醇4.0 mL，混勻，于644 nm下測定吸光度，以質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，試驗重復進行3次，得回歸方程A=0.709 6C+0.004 5，R2=0.999 6，表明γ-氨基丁酸質量濃度在0.2～1.0 mg/mL范圍內呈良好線性關系［10］。

2.1.5 紫花地丁中γ-氨基丁酸的測定取2.1.2項中供試品溶液，按標準曲線繪制方法，測定紫花地丁供試品液吸光度，試驗重復進行3次，計算樣液中γ-氨基丁酸的質量分數得0.298%。

2.2 樹脂的預處理取一定體積的樹脂，先以蒸餾水浸泡12 h，再用40%的NaCl溶液浸泡12 h，然后用2%NaOH攪拌浸泡5 h，水洗至中性，再用5%HCl攪拌浸泡5 h，水洗至中性，最后用70%乙醇浸泡12 h，水洗至無絮狀物。

2.3 樹脂對紫花地丁γ-氨基丁酸的靜態實驗

2.3.1 靜態吸附試驗準確稱取預處理好的7種樹脂各1.00 g，裝入具塞磨口三角瓶中，準確加入0.5 mg/mL的紫花地丁提取液20 mL，于25℃恒溫振蕩24 h，充分吸附后，過濾，測定濾液中γ-氨基丁酸的濃度，按下列公式計算各樹脂在室溫條件下的吸附量和吸附率。

式中:Q為吸附量(mg/g);E為吸附率(%);C0為吸附前溶液的質量濃度(mg/mL);C1為吸附后溶液的質量濃度(mg/mL);V0為吸附前溶液的質量體積(mL);V1為吸附后溶液的體積(mL);W為樹脂質量(g)。

2.3.2 靜態解吸試驗取按2.3.1項方法吸附飽和的樹脂，用pH值8.5的NaOH溶液10 mL解析24 h后，過濾，測定濾液中γ-氨基丁酸的含有量，按下列公式計算解吸率。

式中:D為解吸率(%);C0為吸附前溶液的質量濃度(mg/mL);C1為吸附后溶液的質量濃度(mg/mL);C2為解吸后溶液的質量濃度(mg/mL);V0為吸附前溶液的體積(mL);V1為吸附后溶液的體積(mL);V2為解吸后溶液的體積(mL)［11］。見表1。

表1 7種樹脂對紫花地丁γ-氨基丁酸的吸附率和解吸率(n=3)

由表1通過比較7種樹脂對紫花地丁中γ-氨基丁酸吸附率和解吸率的差異可以看出，LX-17樹脂對紫花地丁中γ-氨基丁酸有較好的吸附率和解吸率。故選用LX-17樹脂為紫花地丁γ-氨基丁酸純化用吸附劑。

2.4 LX-17樹脂對紫花地丁中γ-氨基丁酸吸附動力學試驗

在靜態吸附的基礎上選擇LX-17樹脂進行吸附動力學試驗。精密量取10 mL LX-17樹脂濕法裝柱，以1.0 BV/10 min流速將質量濃度為0.123 mg/mL的紫花地丁提取液上柱，吸附后開始收集流出液，每份收集10 mL，共收集8份，重復3次，以流出液體積為橫坐標，吸附率為縱坐標，作LX-17樹脂對紫花地丁中γ-氨基丁酸的動態吸附曲線。見圖1。

圖1 動態吸附曲線圖

由圖1的動態吸附曲線可以看出，LX-17樹脂對紫花地丁γ-氨基丁酸的吸附較快，當收集第二管時吸附率達94%以上，從吸附達飽和的時間和吸附率考慮，LX-17樹脂適宜對紫花地丁γ-氨基丁酸進行純化。

2.5 LX-17樹脂對紫花地丁中γ-氨基丁酸動態吸附條件的選擇

2.5.1 樣液質量濃度的選擇準確量取10 mL處理好的LX-17樹脂濕法裝柱，分別將質量濃度為0.123、0.133、0.156、0.189、0.216、0.257 mg/mL的紫花地丁提取液，以1.0 BV/10 min上樣，重復3次，考察不同上樣液質量濃度時，LX-17樹脂對紫花地丁γ-氨基丁酸吸附性能的影響［12］。見圖2。

圖2 樣液質量濃度對吸附率的影響

由圖2可見，上樣液質量濃度對吸附率有影響，隨著樣液質量濃度的增大，LX-17樹脂對紫花地丁γ-氨基丁酸的吸附率逐漸降低，當樣液質量濃度為0.123 mg/mL時，吸附率較大，吸附效果較好，故選擇上樣液質量濃度為0.123 mg/mL。

2.5.2 上柱樣液pH值的選擇準確量取10 mL處理好的LX-17樹脂濕法裝柱，分別將質量濃度為0.123 mg/mL不同pH值的紫花地丁提取液，以1.0 BV/10 min上樣吸附流速上樣，重復3次，考察不同pH值時，LX-17樹脂對紫花地丁中γ-氨基丁酸吸附性能的影響［13］。見圖3。

由圖3可見，上樣液的pH值對吸附率有影響，當樣液pH為3.0時，吸附率較大，吸附效果較好，故選擇上樣液的pH值為3。

圖3 樣液pH值對吸附率的影響

2.5.3 上柱樣液流速的選擇準確量取10 mL處理好的LX-17樹脂濕法裝柱，將質量濃度為0.123 mg/m L的紫花地丁提取液，分別以0.5、1.0、1.5、2.0 BV/10 min的流速上柱，重復3次，考察不同上柱流速時，LX-17樹脂對紫花地丁中γ-氨基丁酸吸附性能的影響。見圖4。

圖4 上柱體積流量對吸附率的影響

由圖4可見，隨著上柱流速的增加，吸附率逐漸下降。由于流速過快目標成分分子來不及擴散并吸附到樹脂內表面就已流出，因此上柱流速慢有利于吸附，故選取上樣吸附流速為0.5 BV/10 min。

2.6 紫花地丁中γ-氨基丁酸動態洗脫效果的影響

2.6.1 洗脫劑pH值對洗脫效果的影響按照最優動態吸附條件上柱，充分吸附達飽和后，依次用pH值為7.5、8.0、8.5、9.0的NaOH溶液洗脫，重復3次，根據解吸率的大小確定洗脫劑的最佳pH值。見圖5。

圖5 洗脫劑pH值對解吸的影響

由圖5可見，洗脫劑pH值對洗脫效果有影響，洗脫劑pH值在7.5～8.5的范圍內，隨著洗脫劑pH值的升高，洗脫液吸光度值逐漸升高，當洗脫劑pH值為8.5時，吸光度值達最大值，超過8.5以后，隨著洗脫劑pH值的升高，吸光度值又降低，故選擇洗脫劑pH值為8.5。

2.6.2 不同洗脫流速對洗脫效果的影響按照最優動態吸附條件上柱，充分吸附達飽和后，用pH8.5的NaOH溶液分別以0.5 BV/10 min、1.0 BV/10 min、1.5 BV/10 min、2.0 BV/10 min的流速進行洗脫，重復3次，根據解吸率的大小確定最佳洗脫流速。見圖6。

圖6 洗脫流速對解吸的影響

由圖6可見，當洗脫流速為1.0 BV/10 min時，洗脫液吸光度值過最大值，故選擇洗脫劑流速為1.0 BV/10 min。2.6.3洗脫曲線的制作按照最優動態吸附條件上柱，充分吸附達飽和后，讓樹脂充分吸附γ-氨基丁酸。用pH=8.5的NaOH溶液以1.0 BV/10 min流速洗脫，每份收集10 mL，共收集8份，重復3次。以流出液體積為橫坐標，γ-氨基丁酸濃度為縱坐標，作洗脫曲線圖。見圖7。

圖7 洗脫曲線圖

由圖7可見，當收集第一管洗脫液時，洗脫液吸光度值最大。隨著洗脫液體積的增加，吸光度值逐漸降低。用3倍樹脂床體積的洗脫劑基本上可將γ-氨基丁酸洗脫下來，且洗脫峰較集中。

2.7 驗證實驗量取LX-17樹脂50 mL共3份，預處理后，裝柱。調整上樣液pH值3.0后，以0.5 BV/10 min的流速上樣500 mL，用pH值8.5的NaOH溶液洗脫3 BV，洗脫流速1.0 BV/10 min，收集洗脫液，減壓濃縮，50℃干燥得γ-氨基丁酸質量分數分別為15.16%、15.21%、15.30%的產品。以此提取純化工藝制備γ-氨基丁酸平均收率為5.34%。

3 討論

大孔樹脂技術在中藥研究中已日趨成熟，應用前景日益廣泛。紫花地丁中含有大量生物活性成分，所以γ-氨基丁酸的富集純化存在一定的困難。本實驗首先通過靜態試驗，比較了7種大孔樹脂對γ-氨基丁酸的吸附和解吸特性，隨后通過單因素對比試驗，考察了最佳動態吸附和洗脫條件。驗證試驗結果表明，LX-17樹脂適宜紫花地丁中γ-氨基丁酸的純化，按最佳條件進行紫花地丁中γ-氨基丁酸的純化可得質量分數為15.22%的產品，為后續精制高純度的γ-氨基丁酸產品打下了重要基礎。

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