紅曲霉液體發酵合成 γ－氨基丁酸的研究

史紅征 吳彥彥 史曉靜 鐘凱 魏旭穎 朱會霞

γ-氨基丁酸是一種天然的、食品級的、對人體具有多種功效的非蛋白質氨基酸，由谷氨酸經谷氨酸脫羧酶催化脫羧而來。2009年，原衛生部允許γ-氨基丁酸在食品生產加工中適量添加使用。食品工業中生產γ-氨基丁酸常用微生物發酵法，紅曲霉是其中最常用的微生物。本文通過研究發酵對紅曲霉γ-氨基丁酸生物合成的影響，為紅曲霉高產γ-氨基丁酸培養條件的優化提供依據。

一、菌種

紅曲霉菌種保存于衡水學院發酵工程實驗室。

二、實驗與方法

1.紅曲霉的液體培養。將斜面紅曲霉菌株接種至液體豆芽汁培養基中，在30℃條件下培養5d，將菌絲球再次轉接液體培養基后分成2組，一組在搖床上經30℃、150r/min震蕩培養;另一組經30℃靜置培養，每日觀察。

2.γ-氨基丁酸的含量測定。按照劉夢云等《GABA產生菌的篩選以及檢測方法的比較研究》，測定γ-氨基丁酸的含量。

3.培養基的優化。前期實驗所用的是豆芽汁、葡萄糖和酵母膏的液體培養基，從成本考慮改為豆粕粉、大米粉和酵母膏的液體培養基，做正交試驗確定培養基。

4.分析優化后的培養基的最佳轉速。優化的培養基中因為加入了豆粕粉和大米粉而變得粘稠，將優化培養基接種紅曲霉菌種，然后分別在90r/min、120r/min、? ? ? ? ? ? ? 150r/min、180r/min、210r/min的轉速下，在搖床上經30℃培養。觀察培養基的變化，并測定γ-氨基丁酸的含量以確定最佳轉速。

三、結果與分析

1.紅曲霉靜置培養和搖床培養液體培養狀態的差異。（1）靜置培養的紅曲霉液體培養物因為沒有搖床的震蕩分散作用，形成的菌絲粘連為片狀且為白色。隨著培養時間的增加，紅曲霉菌絲逐漸增多且成團，菌絲團中間的顏色也變為紅色，邊緣的菌絲仍為白色，培養液的顏色變化不明顯。（2）在搖床中培養的液體培養物由于震蕩、分散和回旋的作用，發酵液中供氧充足有利于菌絲的擴增，形成了大量的菌絲球。隨著培養時間的增加，菌絲球漸漸變大，其顏色由白色變為紅色;培養液的顏色漸漸加深，最后變為紫紅色，其主要是由紅曲色素的積累增加所導致。

2.紅曲霉液體培養菌絲觀察。（1）觀察不同培養時間下搖床菌絲的形態，初期菌絲有橫膈、無色透亮;中期菌絲開始出現無規則的分支，菌絲之間網狀聯合、分布密集;培養后期菌絲體開始形成孢子并不斷生長，并有部分孢子萌發。（2）靜置狀態下培養的紅曲霉菌絲分支較少，且菌絲分布稀疏、密度較小，更易觀察。通常在梗頂端生出倒梨形或球形的分生孢子。

3.γ-氨基丁酸含量的測定。（1）隨著紅曲霉培養時間的增加，搖床培養液和靜置培養液中的γ-氨基丁酸生成量均逐漸增多，在培養至第5天時均達到最大值（搖床培養液和靜置培養液中分別是113.9mg/L和93.5mg/L），并且搖床培養液中的γ-氨基酸含量高于靜置培養液。在此基礎上繼續培養，搖床培養液和靜置培養液中的γ-氨基丁酸含量反而下降。（2）每天將紅曲霉搖床培養基和靜置培養基過濾后獲得菌絲，測定菌絲中的γ-氨基丁酸含量，其也隨培養天數的增長而增加。但菌絲中γ-氨基丁酸含量達到最大值的時間與培養液有差異，在第6天時γ-氨基丁酸達到最大值（搖床培養菌絲和靜置培養菌絲中分別是101.3mg/L和94.6mg/L）。

搖床培養液和菌絲中的γ-氨基丁酸含量均分別高于靜置培養液和菌絲中的含量，原因在于紅曲霉是極好氧微生物，搖床培養比靜置培養能提供更多氧，有利于基質轉化為γ-氨基丁酸。因此，紅曲霉合成γ-氨基丁酸的最佳方式是搖床培養，在此條件下最佳發酵天數是5d。綜上可知，搖床培養液中的γ-氨基丁酸含量高于搖床菌絲。搖床培養液中的γ-氨基丁酸含量高，并且能快速地應用工業方法提取，而從菌絲中提取γ-氨基丁酸的工藝復雜、消耗較大，在工業生產中并不實用。

4.優化液體培養基。對R值（表1）進行分析發現，豆粕粉的影響最大，大米粉的影響較小，而酵母膏對γ-氨基丁酸的產量基本沒有影響。分析K值，確定三種原料的最佳比例是A2B2C1，即每1L培養基中加入豆粕粉20g、大米粉40g、酵母膏5g。然而，A2B2C1組合并未在正交實驗中出現，因此需進行驗證實驗。驗證實驗證實，A2B2C1組合的γ-氨基丁酸含量為240.31mg/L，高于正交實驗中最高量233.41mg/L，說明正交實驗得到的最優組合的確為γ-氨基丁酸含量最高的培養基配比。

5.搖床轉速對紅曲霉合成γ-氨基丁酸的影響。90r/min培養物中基本沒有泡沫，γ-氨基丁酸含量為182.7mg/L;120r/min和150r/min培養物中的泡沫很少，γ-氨基丁酸含量分別為216.3mg/L和260.1mg/L;180r/min培養物中，γ-氨基丁酸含量為為268.7mg/L，但產生的泡沫很多，有染菌的危險，而且γ-氨基丁酸產量與150r/min產量相差不多;210r/min培養物中的γ-氨基丁酸含量為223.6mg/L，但產生太多的泡沫，損失較大。因此，150r/min進行搖床培養是生產γ-氨基丁酸的最佳轉速條件。

四、結論

本文分析了培養條件、培養基組成、搖床轉速等因素對紅曲霉中γ-氨基丁酸合成的影響，實驗結果將為紅曲霉合成γ-氨基丁酸的進一步研究提供理論依據。

基金項目：國家級大學生創新創業訓練計劃項目，項目編號：202010101008。

作者簡介：史紅征（2000-），女，河北保定人，在讀本科，研究方向為食品質量與安全。

*通信作者：朱會霞（1977-），女，河北景縣人，教授，博士研究生，研究方向為發酵工程、中藥發酵。