HPLC法測定新疆羅布麻茶中的蘆丁和槲皮素

王省超，王瑞英，*，孫穎，張泰白，張龍燕

（1．新疆大學理化測試中心，新疆烏魯木齊830046；2．新疆產品質量監督檢驗研究院，新疆烏魯木齊830004；3．新疆大學化學化工學院，新疆烏魯木齊830046）

羅布麻又名野麻、茶葉花，分為紅麻和白麻兩種，是屬夾竹桃科多年生的半灌木，主要生長在沙漠鹽堿地、河岸、山溝的砂質地，盛產于我國西北區域，如新疆、甘肅、青海和寧夏等多個省市區。因最早發現在新疆羅布泊，故名為羅布麻[1]。大量研究表明，羅布麻的主要化學成分為黃酮類化合物、氨基酸、脂肪酸醇酯及多種礦物質元素等[2-4]，其中，黃酮類化合物主要分布在羅布麻葉中。羅布麻茶是由羅布麻葉干燥后經傳統制茶工藝制成。研究發現，黃酮類化合物對改善血液循環、預防和治療高血壓、降血脂、平肝安神、抑菌延衰抗氧化等方面具有顯著作用[5-9]。羅布麻茶中的黃酮類化合物以蘆丁、槲皮素等為主，因而測定羅布麻茶中蘆丁和槲皮素的含量具有重要意義。

本文以新疆羅布麻茶為研究對象，提取該茶中的蘆丁和槲皮素，建立高效液相色譜法對其含量同時進行分析，并初步探討提取方法、提取溫度、提取溶劑及料液比對蘆丁和槲皮素含量的影響，以期為羅布麻的進一步研究與開發應用提供一定的參考。

1 儀器與材料

Agilent 1100 型高效液相色譜系統，四元梯度泵，真空脫氣機，自動進樣器，柱溫箱，二極管陣列檢測器及Agilent 化學工作站；KHS200 超聲波清洗器：江蘇昆山禾創超聲儀器有限公司；RT-205 型電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；Millpore 超純水器：美國，Millpore 公司。

蘆丁和槲皮素對照品均購自中國藥品生物制品檢定所；羅布麻茶購于新疆烏魯木齊市濟康大藥房；甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品儲備液

分別精密稱量對照品適量，用色譜純甲醇溶解、定容至25 mL 的容量瓶中，分別配制成含蘆丁0.342 mg/mL 和槲皮素0.124 mg/mL 的對照品儲備液，置于4 ℃的冰箱中保存備用。

2.1.2 對照品溶液

精密吸取1 mL 蘆丁對照品儲備液和2 mL 槲皮素對照品儲備液，置于10 mL 的容量瓶中，用色譜純甲醇定容，配制成含蘆丁0.034 2 mg/mL 和槲皮素0.024 8 mg/mL 的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液

精密稱取羅布麻茶粉末（過70 目篩）3 g，置于50 mL圓底燒瓶中，加入45 mL 70 %的乙醇溶液，超聲提取2 h，定容至50 mL 的容量瓶中，經0.45 μm 的濾膜過濾后，用于HPLC 分析。

2.2 色譜條件

色譜柱為Agilent TC-C18（150×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.3%磷酸水溶液（40∶60，體積比）；流速為1.0 mL/min，檢測波長360 nm，柱溫為30 ℃；進樣量為5 μL。在該色譜條件下，對照品蘆丁和槲皮素分離較好（如圖1），對于供試品，盡管羅布麻茶中成分較多，蘆丁和槲皮素在該色譜條件下仍然實現了良好分離，滿足定量分析需要（如圖2）。

2.3 線性關系考察

按“2.2”色譜條件，分別將對照品溶液依次進樣1、2、4、8、12、16、20 μL，以Y（AV·S）為峰面積，X（μg）為進樣質量，蘆丁和槲皮素的方程分別為：Y=879.399 6X+2.891 9，r=1.000 00；Y=952.703 0X-2.003 9，r=0.999 90。結果表明，蘆丁在0.0342 μg～0.684 μg 和槲皮素在0.0248 μg～0.496 μg 間呈良好線性關系（圖3）。

2.4 精密度實驗

取上述對照品溶液進樣，每次10 μL，重復進樣5次，按上述色譜條件測定峰面積，蘆丁和槲皮素的RSD 分別為0.45%和0.80%（n=5），表明本方法精密度良好。

2.5 重現性實驗

精密稱取同一羅布麻茶樣品5 份，按“2.1.3”方法制備供試溶液，在“2.2”色譜條件下分別測定蘆丁和槲皮素含量，其RSD 分別為1.82%和1.81%（n=5），表明本方法重現性良好。

2.6 回收率實驗

精密稱取5 份不同質量的羅布麻茶，分別加入1 mL 的對照品，按“2.1.3”制備供試品溶液，在“1.4.3”色譜條件下分別進樣10 μL，計算回收率。結果表明蘆丁和槲皮素的加樣平均回收率分別為99.94 %和99.48%，其RSD 分別為0.82%和0.60%（n=6）（表1）。

表1 回收率實驗結果Table 1 The results of recovery

2.7 穩定性實驗

取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12 h按上述色譜條件測定峰面積，蘆丁和槲皮素的RSD 分別為1.06%和1.80%，結果表明供試品溶液中的蘆丁和槲皮素在12 h 內穩定。

2.8 樣品的測定

按“2.1.3”方法制備的四份樣品溶液，采用“2.2”色譜條件進行分析測試，得到羅布麻茶樣品含量，結果見表2。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

為了精確檢測蘆丁和槲皮素的含量，優選檢測波長非常重要。將二極管陣列檢測器分別設定檢測波長為220、247、280、320、360 nm，在相同的色譜條件下進樣分析。實驗結果表明，蘆丁和槲皮素在360 nm 下色譜峰面積較大、分離效果較好，且羅布麻茶中的其它成分在此波長下干擾較小，故選擇360 nm 為最佳檢測波長。

表2 羅布麻茶中蘆丁和槲皮素的含量Table 2 Content of rutin and quecertin in Luobuma tea

3.2 流動相的選擇

根據蘆丁和槲皮素的極性大小[10]，本文選擇甲醇和水作為流動相。為確定甲醇和水的比例，分別選擇在30∶70、40∶60 和50∶50 不同比例下對供試品溶液進行分析。結果表明，當甲醇和水的比例為40∶60 時，供試品中蘆丁和槲皮素分離效果較好，且各峰對稱性良好，既能達到基線分離的要求，又有適宜的保留時間。由蘆丁和槲皮素的結構（圖4）可知，兩者結構中存在大量羥基，是酸解離基化合物，因此，為了抑制其解離以減少拖峰現象，在流動相中加入0.3 %磷酸作為酸抑制劑[11]。本實驗流動相為甲醇：0.3 %磷酸水溶液=40∶60。

3.3 提取方法的選擇

圖5 為不同提取方法與蘆丁和槲皮素提取效率的關系圖。由圖5 可知，在相同時間范圍內，超聲法對蘆丁和槲皮素的提取量均明顯高于熱回流法。這是因為超聲波是一種具有強彈性的波，其振動不僅會產生較大的能量，使體系溫度升高，進而加速提取物在溶劑中的擴散，而且還會使媒質質點產生較大的速度和加速度，增加溶劑與提取物的接觸面，快速穿透植物體，使植物中的有效成分快速從細胞中剝離出來進入溶劑[12-14]，最終實現快速提取。

3.4 提取溶劑及濃度的影響

蘆丁和槲皮素都是多羥基黃酮類化合物，極性較強，易溶于強極性溶劑，但其結構中具有苯環和碳碳雙鍵等而微溶于水，所以在羅布麻茶葉蘆丁和槲皮素含量的測定中，我們對不同極性的提取溶劑（如不同濃度的乙醇）進行單因素實驗考察，實驗結果如圖6 所示。

由圖6 可知，當乙醇濃度低于60%時，隨乙醇濃度的增加，蘆丁提取量變化不明顯，槲皮素提取量明顯增加；當乙醇濃度高于60%時，隨著乙醇濃度的增加，蘆丁的提取量明顯減小，槲皮素提取量的變化較小。這可能是因為蘆丁的結構中有羰基和羥基且分子量大，極性相對較強，而槲皮素結構中的羥基少，極性相對較弱的緣故。綜合考慮，選擇60%的乙醇作為提取溶劑。

3.5 超聲時間的影響

超聲時間的長短直接影響蘆丁和槲皮素的提取量。圖7 是不同超聲時間與蘆丁和槲皮素提取量的關系圖。

由圖7 可知，超聲時間對黃酮類化合物蘆丁和槲皮素的提取影響較大。隨著超聲時間的增加，蘆丁和槲皮素的提取量同時增加，當超聲時間超過60 min 后蘆丁和槲皮素的提取量減小。這是因為在0～60 min內，溶劑蒸汽壓和溫度將隨超聲時間的增加而逐漸升高，大的蒸汽壓和適宜的溫度有利于蘆丁和槲皮素的浸出，使蘆丁和槲皮素的提取量逐漸增加。但是，提取過程是一個放熱反應，溫度越高越不利于蘆丁和槲皮素的浸出[15]。所以當超聲60 min 后，隨著時間的延長，蘆丁和槲皮素的浸出量逐漸變小。故本實驗在超聲時間為60 min 時，蘆丁和槲皮素提取量最大。

3.6 料液比的影響

料液比是影響蘆丁和槲皮素提取量的一個重要因素。圖8 為蘆丁和槲皮素的提取量與料液比的關系圖。

由圖8 可知，隨著溶劑量的增加，蘆丁和槲皮素的提取量均逐漸增大，當料液比為1∶15（g/mL）時，蘆丁和槲皮素的提取量同時達到最大，當溶劑體積繼續增加時，蘆丁和槲皮素的量反而減小。這可能是由于當溶劑量在一定的范圍內時，隨著溶劑量的增加，羅布麻茶吸收的超聲波能量不斷增加，黃酮類化合物蘆丁和槲皮素的浸出量逐漸增大；當溶劑體積過大時，羅布麻茶葉吸收能量變小，蘆丁和槲皮素的溶解量也隨之減小。因此，蘆丁和槲皮素的最佳料液比是1∶15。

4 結論

本文建立了簡便、快速的高效液相色譜法，同時測定了羅布麻茶中蘆丁和槲皮素的含量，并對影響蘆丁和槲皮素提取量的提取方法、提取溫度、提取溶劑及料液比等因素進行研究。結果表明，蘆丁在0.0342μg～0.684 μg（r=1.000 00）和槲皮素在0.024 8 μg～0.496 μg（r=0.999 90）范圍內線性關系良好，其加樣平均回收率分別為99.94%和99.48%，蘆丁和槲皮素的精密度實驗RSD 分別為0.45%和0.80%（n=5），適合羅布麻茶中蘆丁和槲皮素的同時測定。采用超聲法提取蘆丁和槲皮素的效率大于熱回流。超聲法提取蘆丁和槲皮素的最佳條件為：超聲60 min，料液比1∶15，60%的乙醇為提取溶劑。本文的測定結果為羅布麻的進一步研究與開發應用提供一定的理論依據。

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