鹽生植物鹽地堿蓬質膜Na╋/H╋逆向轉運蛋白基因片段的克隆及其序列分析

王生銀，馬 清，王鎖民

(草地農業生態系統國家重點實驗室 蘭州大學草地農業科技學院,甘肅 蘭州 730020)

鹽害是導致農作物減產的主要非生物因素之一[1-2]，土壤中高濃度的Na+會擾亂植物正常的代謝活動，影響根系對K+和其他必需元素的吸收，產生滲透脅迫并誘發氧化脅迫等次生脅迫，從而導致植物生長受到抑制，甚至死亡[3-4]。鹽生植物在漫長的進化過程中，形成了其特殊的耐鹽機制。對其耐鹽機理的研究以及耐鹽功能基因的挖掘在農作物和優良牧草耐鹽性的遺傳改良方面有著重要的應用價值。

鹽地堿蓬(Suaedasalsa)又名鹽蓬、蓬子菜和鹽蒿，屬藜科堿蓬屬一年生多汁草本鹽生植物，生于鹽漬化土壤、湖濱、河岸和沿海地帶，可在400 mmol·L-1的鹽濃度下完成其生活史[5]，是典型的鹽堿地指示植物[6]，也是研究植物耐鹽機制極好的基因庫[7-8]。鹽地堿蓬能夠在含鹽量很高的土壤中正常生長，原因在于其根系吸收的Na+能夠有效地運輸到植株地上部并儲存在液泡中，從而降低植株地上部的水勢，提高植株的吸水能力，同時也避免了離子在細胞質中過多積累而擾亂植物正常生理生化代謝活動[9-10]。然而，有關Na+從鹽地堿蓬根部向地上部運輸機制的研究尚未見報道。近來研究表明，參與Na+從細胞中外排的質膜Na+/H+逆向轉運蛋白 (SOS1) 可能參與此過程[11-13]。

質膜Na+/H+逆向轉運蛋白的活性首先在大麥(Hordeumvulgare)中發現，并確定其主要與Na+的外排有關[14]，是植物抗拒鹽離子毒害的首個屏障，質膜 H+-ATPase為其提供能量[15-16]。隨后相繼從擬南芥(Arabidopsisthaliana)[4,16-18]、水稻(Oryzasativa)[18]、小花堿茅(Puccinelliatenuiflora)[19]等植物中克隆了編碼質膜Na+/H+逆向轉運蛋白的基因，并確定其參與植物根部Na+的外排[20-22]。然而，Shi等[17]發現，在輕度鹽脅迫(25 mmol·L-1NaCl)下，擬南芥質膜Na+/H+逆向轉運蛋白 (AtSOS1) 的功能是將Na+裝載進入根木質部，以便于Na+向植株地上部轉移并最終存貯在葉肉細胞的液泡中；而在重度鹽脅迫(100 mmol·L-1NaCl)下，AtSOS1的功能可能是從根的木質部中卸載Na+，從而在鹽脅迫下調節Na+通過木質部向植株地上部的運輸，減輕過多的 Na+對葉的傷害。Olías等[12-13]研究表明，在鹽脅迫下，番茄(Solanumlycopersicum)質膜Na+/H+逆向轉運蛋白(SlSOS1)可能通過控制Na+的長距離運輸來調控Na+在植物體不同器官中的分布，使Na+大量積累在莖中，從而保護根及重要的光合器官免受Na+毒害。然而，目前對SOS1的研究主要集中在模式植物和甜土植物上，對于鹽生植物SOS1的研究相對較少，特別是對積鹽型鹽生植物的研究尚未見報道。本研究采用 RT-PCR方法克隆積鹽型植物鹽地堿蓬的SOS1基因片段并分析其序列特征，以期為鹽地堿蓬SOS1全長基因的克隆、表達調控等研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1試驗材料 植物材料為4周齡鹽地堿蓬幼苗，種子采自內蒙古自治區查干諾爾湖。大腸桿菌DH5α菌株在草類逆境生理與基因工程實驗室保存。

1.2研究方法

1.2.1材料培養 參照馬清等[23]的方法。挑選籽粒飽滿、無缺損、均勻一致的鹽地堿蓬種子，用蒸餾水沖洗2～3遍，在28 ℃下，經蒸餾水浸種催芽24 h。待發芽后，移至滅菌的紅沙中，在溫室中澆灌Hoagland營養液進行植物材料培養；Hoagland營養液包括6 mmol·L-1KNO3、1 mmol·L-1NH4H2PO4、0.5 mmol·L-1MgSO4·7H2O、0.5 mmol·L-1Ca(NO3)2·4H2O、60 μmol·L-1Fe-citrate、92 μmol·L-1H3BO3、18 μmol·L-1MnCl2·4H2O、1.6 μmol·L-1ZnSO4·7H2O、0.6 μmol·L-1CuSO4·5H2O、0.7 μmol·L-1(NH4)6Mo7)24·4H2O；溫室的晝夜溫度為(28±2) ℃/(23±2) ℃，光照時間16 h·d-1，光照強度約600 μmol·m-2·s-1，相對濕度60%～80%。

1.2.2總RNA的提取 取150 mmol·L-1NaCl處理48 h的4周齡鹽地堿蓬幼苗根系，加入液氮研磨至粉末狀，按照UNIQ-10 柱式Trizol總RNA抽提試劑盒的操作說明書提取根系總RNA。用1.0%甲醛變性凝膠電泳鑒定其完整性和質量。

1.2.3引物的設計與合成 參照馬清等[24]的方法，通過對其他植物SOS1核苷酸序列進行同源性比較，找出高度保守的區段，根據同源性高和簡并性低的原則，利用DNAMAN和Primer 5.0軟件設計一對簡并引物P1和P2，用于擴增鹽地堿蓬SOS1基因片段，推測目的片段的長度為736 bp，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

P1：5’- GCATCA(C/T)TT(C/T)TGGGA(A/G)ATGGT -3’；

P2：5’- AT(C/T)CT(C/T/G)CC(C/T)TCATC(A/G)AGCAT -3’。

1.2.4RT-PCR擴增 參照郭強等[24]的方法。PCR擴增反應體系：在200 μL PCR管中依次加入10×PCR Buffer 5 μL、25 mmol·L-1MgCl23.5 μL、2 mmol·L-1dNTP 5 μL、10 μmol·L-1P11 μL、10 μmol·L-1P21 μL、Taq DNA polymerase (5 U·μL-1) 0.5 μL、cDNA 2 μL，加純水至50 μL。反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，51 ℃退火50 s，72 ℃延伸60 s，30個循環；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠檢測，目的片段的回收和純化按照UNIQ-10柱式DNA 膠回收試劑盒操作說明進行。

1.2.5陽性克隆的篩選與鑒定 參照郭強等[24]的方法。將回收的PCR產物連接到pUCm-T載體，轉化感受態大腸桿菌DH5α，用含有50 μg·mL-1氨芐青霉素的LB固體培養基進行藍白斑篩選，轉化白斑菌株經質粒PCR鑒定確認陽性克隆后，送至北京華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.6序列分析 序列的比較、翻譯等在DNAMAN生物軟件上進行，Blast搜索在NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) 網站上進行。

2 結果

2.1RT-PCR擴增 以鹽地堿蓬根系為材料提取的總RNA反轉錄所得到的第一鏈cDNA為模板，用簡并引物P1和P2進行PCR擴增。擴增產物經凝膠電泳檢測發現約在736 bp處有1條亮帶，且上下無雜帶，與目的片段大小一致 (圖1)，推測可能是鹽地堿蓬SOS1基因片段。

2.2陽性克隆的鑒定 將回收純化的目的片段連接到pUCm-T克隆載體上，轉化大腸桿菌DH5α。從轉化的平板上隨機挑取2個白色菌斑并提取質粒，進行PCR擴增，得到的擴增片段大小約為736 bp(圖2)，與RT-PCR結果一致，表明這些克隆為陽性克隆。

2.3SOS1基因片段序列分析 測序結果顯示，該陽性克隆序列長度為736 bp，推測其編碼244個氨基酸 (圖3)。Blast比較結果表明，該片段與海松菜(Suaedajaponica)、鹽角草(Salicorniabrachiata)、冰葉日中花(Mesembryanthemumcrystallinum)和霸王(Zygophyllumxanthoxylum)等植物SOS1核苷酸序列的同源性均在74%以上，其中與海松菜SjSOS1(AB198179.1)核苷酸序列的同源性高達95%。表明本研究克隆到的片段為SOS1 基因片段，將其命名為SsSOS1。

圖1 RT-PCR產物凝膠電泳圖

圖2 陽性克隆的PCR鑒定

圖3 鹽地堿蓬SsSOS1核苷酸序列及推測的氨基酸序列

多重比較及系統進化分析表明，鹽地堿蓬SsSOS1片段與藜科植物[如海松菜SjSOS1和鹽角草SbSOS1(EU879059.1)]的進化關系非常近，氨基酸同源性分別高達98%和90%；與其他雙子葉植物如冰葉日中花McSOS1(AM746987.1)和霸王ZxSOS1(GU177864.1)的進化關系相對較遠，同源性分別為77%和69%；而與單子葉植物如小花堿茅PtSOS1(GQ452778.1)的進化關系最遠，同源性僅為61%(圖4、圖5)。此外，鹽地堿蓬SsSOS1氨基酸序列包含4個跨膜區，相對于非跨膜區而言，跨膜區則具有更高的同源性(圖4、圖5)。

3 討論

絕大多數高等植物的質膜Na+/H+逆向轉運蛋白均由單基因編碼[16,18]。該蛋白N末端為一個疏水結構,主要負責Na+的轉運[16]，可能由10～12個跨膜結構域組成,不同物種間SOS1的高度同源區域主要位于該端。本研究克隆的SsSOS1片段位于其N末端，包含4個跨膜區，與其他植物SOS1核苷酸的同源性在74% 以上，編碼氨基酸的同源性在61%以上，相對于非跨膜區而言，跨膜區具有更高的同源性(圖4、圖5)。系統進化分析表明，本研究克隆的鹽地堿蓬SsSOS1片段與雙子葉黎科植物如海松菜SjSOS1和鹽角草SbSOS1的進化關系最近，與其他雙子葉植物如冰葉日中花McSOS1和霸王ZxSOS1的進化關系相對較遠，而與單子葉植物(如小花堿茅PtSOS1)的進化關系最遠(圖5)?？梢?，不同植物質膜Na+/H+逆向轉運蛋白在進化上具有一定的差異，尤其是在單子葉和雙子葉植物之間，這種差異更明顯[23]。

圖4 SsSOS1氨基酸序列與其他植物SOS1氨基酸序列的多重比較

圖5 SsSOS1與其他植物SOS1的系統進化樹

SOS1作為植物膜系統的一種轉運蛋白，參與細胞內Na+濃度的控制、pH值調節和細胞體積變化等一系列重要的生命活動[25]。除上述功能外，SOS1在控制Na+長距離運輸方面起著非常重要的作用。Shi等[17]研究表明，在鹽脅迫下，擬南芥質膜Na+/H+逆向轉運蛋白(AtSOS1)可以調節Na+在木質部中從根部向地上部的運輸，減輕過多的Na+對葉造成的傷害。此外，SOS1在維持植物細胞K+穩態平衡方面起著重要作用，其基因突變和表達下調均會影響植物K+吸收及轉運系統的功能，進而破壞細胞K+的穩態平衡[26-27]。同時，SOS1也會影響植物細胞中Ca2+的轉運，其活性受抑制后，液泡膜上與Ca2+轉運有關的基因表達豐度顯著上調，致使液泡中積累大量的Ca2+[28]?？梢?，SOS1在植物耐鹽性方面具有非常重要的作用。本研究成功克隆了SsSOS1基因的核心片段，為SsSOS1全長基因的克隆、表達調控及進一步分析其在鹽地堿蓬Na+長距離運輸及K+、Ca2+穩態平衡中的作用奠定了基礎。

[1]王愛祥，陳愛萍，張博．不同苜蓿品種耐鹽性初探[J]．草業科學，2010,27(3):102-106.

[2]秦峰梅，張紅香，武祎，等．鹽脅迫對黃花苜蓿發芽及幼苗生長的影響[J]．草業學報，2010,19(4):71-78.

[3]Apse M P,Aharon G S,Snedden W A,etal.Salt tolerance conferred by over expression of a vacuolar Na+/H+antiporter in Arabidopsis[J].Science,1999,285:1256-1258.

[4]Zhu J K.P1ant salt tolerance[J].Trends in Plant Science,2001,6:66-71.

[5]陳敏．鹽地堿蓬膜相關蛋白及其在耐鹽中的作用[D]．濟南：山東師范大學,2009:5.

[6]中國科學院《中國植物志》編輯委員會．中國植物志：第二十五卷第二分冊[M]．北京：科學出版社，1979:115-135.

[7]程國強，王萍.鹽地堿蓬耐鹽相關基因克隆研究進展[J]．生物技術通報,2003(5):18-21.

[8]鄒桂梅，蘇德榮，黃明勇，等．人工種植鹽地堿蓬改良吹填土的試驗研究[J]．草業科學，2010,27(4):51-56.

[9]Hasegawa P M,Bressan R A,Zhu J K,etal.Plant cellular molecular responses to high salinity[J].Plant Physiology and Plant Molecular Biology,2000,51:463-499.

[10]Song J,Chen M,Feng G,etal.Effect of salinity on growth,ion accumulation and the roles of ions in osmotic adjustment of two populations ofSuaedasalsa[J].Plant and Soil,2009,314:133-141.

[11]Shi H Z,Lee B H,Wu S J,etal.Over expression of a plasma membrane Na+/H+antiporter gene improves salt tolerance inArabidopsisthaliana[J].Nature Biotechnology，2003,21：81-85.

[12]Olías R,Eljakaoui Z,Li J,etal.The plasma membrane Na+/H+antiporterSOS1 is essential for salt tolerance in tomato and affects the partitioning of Na+between plant organs[J].Plant,Cell and Environments,2009,32:904-916.

[13]Olías R,Eljakaoui Z,Pardo J M,etal.The Na+/H+exchangerSOS1 controls extrusion and distribution of Na+in tomato plants under salinity conditions[J].Plant Signaling and Behavior,2009(4):973-976.

[14]Ratner A,Jacoby B.Effect of K+，its coumter anion，and pH on sodium efflux from barley roots[J].Journal of Experimental Botany,1976,148:425-433.

[15]Blumwald E,Aharon G S,Apse M P.Sodium transport in plant cells[J].Biochimica et Biophysica Acta,2000(1465):140-151.

[16]Shi H Z,Ishitani M,Kim C,Zhu J K.TheArabidopsisthalianasalt tolerance geneSOS1 encodes a putative Na+/H+antiporter[J].Proceeding of the National Academy of Sciences of the USA，2000,97:6896-6901.

[17]Shi H Z,Quintero F J,Pardo J M,etal.The putative plasma membrane Na+/H+antiporterSOS1 controls long distance Na+transport in plants[J].The Plant Cel1,2002,14:465-477.

[18]Martínez-Atienza J,Jiang X,Garciadeblas B,etal.Conservation of the salt overly sensitive pathway in rice[J].Plant Physiology,2007,143:1001-1012.

[19]程玉祥．過量表達星星草PtSOS1提高擬南芥的耐鹽性[J]．植物生理學通訊，2008，44(6):1125-1130.

[20]Oh D H,Leidi E,Zhang Q,etal.Loss of halophytism by interference withSOS1 expression[J].Plant Physiology,2009,151:210-222.

[21]Oh D H,Zahir A,Yun D J,etal.SOS1 and halophytism[J].Plant Signaling and Behavior,2009(4):1081-1083.

[22]Taji T,Seki M,Satou M,etal.Comparative genomics in salt tolerance betweenArabidopsisandArabidopsis-related halophyte salt cress usingArabidopsismicroarray[J].Plant Physiology,2004,135:1697-1709.

[23]馬清，包愛科，伍國強，等．質膜Na+/H+逆向轉運蛋白與植物耐鹽性[J]．植物學報，2011,46(2):206-215.

[24]馬清,周向睿,伍國強,等.鹽生植物堿蓬Actin基因片段的克隆及序列分析[J].生物技術,2009,19(1):1-3.

[25]郭強,周向睿,王沛,等.鹽生植物小花堿茅ptAKTL基因片段的克隆序列分析[J].草地學報,2010,18(5):683-688.

[26]Peng Y H,Zhu Y F,Mao Y Q,etal.Alkali grass resists salt stress through high K+and an endodermis barrier to Na+[J].Journal of Experimental Botany,2004,55:939-949.

[27]Qi Z,Spalding E P.Protection of plasma membrane K+transport by the salt overly sensitivel Na+/H+antiporter during salinity stress[J].Plant Physiology,2004,136:2548-2555.

[28]Oh D H,Lee S Y,Bressan R A,etal.Intracellular consequences ofSOS1 deficiency during salt stress[J].Journal of Experimental Botany,2010,61:1205-1213.