基于SSR標記的茶樹新品種遺傳多樣性分析及指紋圖譜構建

章志芳，馬建強

（中國農業科學院茶葉研究所，國家茶樹改良中心，浙江 杭州 310008）

DNA是生物的基本遺傳物質，DNA水平上的遺傳變異是物種差異最直接的體現。隨著分子生物學技術的發展而形成的DNA分子標記技術，因其多態性好、易操作和標準化、不受環境及作物生育期等因素影響等優點，已成為作物品種鑒定最有效的檢測手段。在一系列的分子標記體系中，SSR標記以其共顯性、操作簡單、通用性好、重現性高等優點，成為最廣泛應用的分子標記。目前我國建立的DNA指紋數據庫大多采用SSR標記體系[1]。

茶樹為多年生木本植物，從幼苗期到成熟投產需要幾年時間，而在茶樹幼苗期通過表型性狀進行品種鑒定十分困難，如若品種混雜，勢必影響生產效益。因此，開發高效準確的品種鑒定方法對于茶樹新品種保護、良種推廣等具有重要意義。茶樹SSR標記的開發和應用較晚，已發表的茶樹SSR標記約300余個[2-4]，且多應用于遺傳多樣性、遺傳結構等研究[5-6]，而在茶樹DNA指紋圖譜方面的報道較少[7]。筆者利用SSR標記對14個茶樹新品種進行遺傳多樣性分析和分子鑒定，并嘗試構建DNA指紋圖譜，以期為今后開展茶樹分子指紋圖譜庫構建、新品種鑒定和評價等研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的14個茶樹樣品（表1）采自中國農業科學院茶葉研究所“國家種質杭州茶樹圃”，選取完整、無病蟲害感染的一芽二葉新梢，經液氮迅速冷凍后保存于-70℃冰箱中備用。

表1 供試的14個茶樹品種

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用改進的CTAB法[8]提取基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer檢測 DNA濃度，稀釋到10 ng/μL用于PCR擴增。

1.2.2 EST-SSR標記 參照喬婷婷[9]、周炎花[10]報道的EST-SSR標記，挑選其中10個多態性較高的標記由上海生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.3 PCR擴增及產物檢測 擴增反應在Bio-Rad PTC-200 PCR儀上進行，反應體系和擴增程序參照喬婷婷[19]的方法。PCR產物用10%的聚丙烯酰胺凝膠在CBS垂直電泳系統上檢測，電泳后參照Charters和Wilkinson的方法進行銀染顯色[11]。

1.2.4 數據統計與分析 每個SSR標記只統計目的片段范圍內的一個等位位點，其中每一條多態性條帶視為一個等位變異，將電泳圖上清晰的條帶記為1，同一位置無帶或不易分辨的弱帶記為0。建立0-1原始數據庫，然后將相同的帶型組合記為一種基因型；并根據分子質量大小，將等位基因從大到小依次記作 1、2、3等，EST-SSR為共顯性標記，對于二倍體茶樹而言，一條帶表示純合，兩條則為雜合，記錄為 11、22、33、12、13、23 等基因型。

使用POPGENE[12]統計每個標記在14個茶樹品種中擴增的等位基因數（Observed number ofalleles，Na），計算有效等位位點（Effective number of alleles，Ne）、等位基因頻率（Allele frequency），觀測雜合度（Observed heterozygosity，HO）、期望雜合度（Expected heterozygosity，HE）、Shannon 信息指數（Shannon’s information index，I）。采用 PowerMarker[13]計算基因型數（Genotype）、多態性信息量（polymorphism information content，PIC）；SSR 位點的多態性信息量PIC=1-∑Pi2，式中Pi表示第i個等位位點出現的頻率；并根據Nei’s遺傳距離[14]構建茶樹品種的無根Neighbor-Joining（NJ）聚類圖。

2 結果與分析

2.1 14個茶樹品種的SSR多態性

10個EST-SSR標記在供試的茶樹品種中均表現出多態性（表2）。其中PIC>0.5的有3個，變異范圍在 0.173（TM283）～0.618（TM209），平均為 0.387，表明這些標記在參試材料中多態性適中；10個標記共檢測到29個等位基因，等位基因數變異范圍為2～4個，平均2.9個；有效等位基因數變異范圍為 1.237（TM283）～3.143（TM209），平均 1.993 個；基因型最多的為 7個（TM209），最少的為 2個（TM136，TM283），平均 3.9 個；遺傳多樣性指數最高的為 TM209（1.213），最低的為 TM283（0.341）。

表2 10個茶樹品種SSR標記的相關特征

2.2 茶樹品種SSR標記等位基因的出現頻率

29個等位基因在試驗品種中的出現頻率差異很大（表3）。TM283的等位基因2出現頻率最高（89.29%）；其次為TM136的等位基因2（84.62%）和TM131的等位基因1（88.46%）。TM280的等位基因1出現頻率最低（3.57%）；其次為TM131的等位基因2和TM215的等位基因3（均為3.85%）。對比表2和表3，可見出現頻率較高的等位基因所對應的SSR標記其遺傳多樣性指數都較低。出現頻率較低的等位基因所在的SSR標記分為兩類：一類是標記的等位基因數較多的標記（TM209，TM211，TM280），另一類是等位基因數較少的標記（TM283）。

表3 SSR標記不同等位基因的出現頻率

2.3 14個茶樹品種的親緣關系

根據10個SSR標記等位基因出現頻率計算Nei’s遺傳距離（D），結果顯示14個茶樹品種的遺傳距離在0.036～0.472之間，其中南江1號和901的遺傳距離最小，表明這兩個品種間親緣關系較近，而鄂茶5號和農抗早的遺傳距離最大，說明這兩品種親緣關系最遠?；贜ei’s遺傳距離，采用NJ法構建品種聚類圖（圖1）。當D=0.12時，14個茶樹品種可聚為三類；第一類包括4個品種，2個來自湖北（五峰212，五峰310），2個來自安徽（石佛翠，農抗早）；第二類包括2個安徽品種（901，石佛香）和1個重慶品種（南江1號）；第三類包括7個品種，其中2個湖北品種（鄂茶5號，鄂茶6號），3個福建品種（茗科3號，茗科4號，早玫瑰），1個四川品種（名山特早芽）和1個江西品種（大葉龍）。

表4 基于SSR標記的14個茶樹品種的DNA身份證編碼

2.4 14個茶樹品種的DNA指紋圖譜

將每個品種經不同標記擴增獲得的等位基因帶型，按照固定標記順序排列，串聯組合成特異的帶型編碼，再轉化為計算機可識別的DNA身份證編碼，即該品種的分子指紋圖譜。為了減少編碼序號長度，通常在構建指紋圖譜時只選用幾個鑒別能力較強的標記。該研究中只需4個SSR標記（TM128，TM280，TM148，TM211）即可鑒定 14 個茶樹品種。因此，將這4個標記作為構建指紋圖譜的核心標記。按照上述標記編號對每個茶樹品種的等位基因帶型組合進行編碼，獲得13位數的DNA身份證編碼（表4），依此構建14個茶品種的指紋圖譜（圖1）。結果顯示，每個茶樹品種都對應一個惟一的指紋圖譜，可較為快速地辨別各個品種。

圖1 基于SSR標記的14個茶樹品種的NJ聚類圖及DNA指紋圖譜

3 討論與結論

3.1 茶樹品種SSR標記等位基因變異

理論上參試品種越多，標記檢測到的等位基因數就越多。喬婷婷[9]研究表明，其試驗選用的10個SSR標記在308份茶樹資源中檢測到的等位基因數變異為 3（TM131，TM283）～8（TM211），平均為4.6，PIC只有 TM283小于 0.5，最高為 0.870（TM128），平均為0.677。而在該研究的14個茶樹品種中檢測到的等位基因數變異為2～4個，平均2.9個，其中9個標記（除TM131）檢測到的等位基因數都少于之前的研究，只有3個標記（TM128，TM209，TM211）PIC 值 大 于 0.5， 最 高 為 0.618（TM209），最低為 0.173（TM283），平均為 0.387。這說明參試材料的不同，可能會造成標記檢測效率差別較大。因此，在構建SSR指紋圖譜庫時應盡可能多地包含核心種植資源，以便獲得更多的特異等位基因。

3.2 茶樹品種SSR標記等位基因出現頻率

該研究中等位基因出現頻率變異范圍為3.57%（TM280）～89.29%（TM283）。其中，出現頻率較高的等位基因所在標記其遺傳多樣性指數都較低。而出現頻率較低的等位基因所在的標記分為兩類：一類是標記的等位基因數較多（TM209，TM211，TM280），但各等位基因出現頻率較分散，使得其中某一個等位基因頻率較低；另一類是等位基因數較少的標記（TM283），但其中某一個等位基因出現頻率極高，而其他等位基因頻率很低。對于這些在試驗材料中出現頻率很低的等位基因，可將其視為特異性等位基因（如TM131等位基因2，TM 209等位基因4，TM215等位基因3，TM280等位基因1），依此便可高效地鑒別具有該特異等位基因的材料，因此也適用于指紋圖譜構建。

3.3 14個茶樹品種的親緣關系

研究結果表明，來自不同省份的14個茶樹品種的Nei’s遺傳距離在0.036～0.472之間，說明這些區試品種的親緣關系較近。這可能是由于試驗所用的14個品種均為選育的綠茶適制性品種，在遺傳背景上可能較相近?；谶z傳距離的NJ聚類圖顯示，當D=0.12時，14個茶樹品種可聚為三類，來源相同的品種基本聚在一起。

3.4 茶樹品種DNA指紋圖譜的構建

標記的多態位點數對SSR分子標記的鑒別力有著重要的正向影響[15]。因此，在構建圖譜時大多選擇多態性較高的標記。該研究中利用4個SSR標記即可將14個茶樹品種全部分開，并根據擴增的等位基因譜帶組合類型將DNA多態性信息直接轉化為計算機化的數字編碼，然后繪制成可視化的條形碼，結果顯示每個品種都有唯一的指紋圖譜，可以快速地對各品種進行鑒定。理論上，在利用SSR標記區分不同品種（二倍體）時，某一基因型的出現頻率為2/（n+1）n（n為等位基因數），那么10個標記則可獲得[（n+1）n/2]10個基因型組合類型。研究中10個SSR標記平均檢測到2.9個等位基因，即理論上可區分3.3×107個品種。由此可見，利用SSR標記構建茶樹指紋圖譜進行品種鑒定具有極大的潛能和應用價值。隨著茶樹基因組測序的進行，可利用的SSR標記將大幅增加，構建覆蓋整個茶樹基因組的茶樹指紋圖譜庫將成為可能，這對于茶樹新品種的選育、鑒定、保護等具有重要意義。

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