不同缺血后處理對大腦中動脈閉塞/再灌注大鼠排斥導向分子a表達的影響

孔渝菡 秦新月 郭振委

(重慶醫科大學附屬第一醫院神經內科 重慶市神經病學重點實驗室，重慶 400016)

腦缺血后處理(IPC)即在腦缺血后再灌注(I/R)初期通過各種物理或藥物方式實施的一種干預手段，是近年來發現的能減少缺血性腦損傷的方法，但其最佳實施策略及具體保護機制仍存在爭議〔1〕。本研究擬探討對大腦中動脈閉塞(MCAO)/再灌注大鼠實施不同方式的IPC對其梗死體積的影響，同時觀察海馬排斥導向分子a(RGMa)這一神經再生中的排斥性導向分子在幾種缺血后處理中的表達，以尋找最有效的IPC方法及推測其可能機制。對于臨床上缺血性腦血管疾病的防治具有積極的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 成年(12周齡)SD大鼠，雌雄各半共90只，由重慶醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK(渝)2007－0001。成年SD大鼠隨機分為假手術組、大腦中動脈IR模型組、IPC－S組(頸總動脈10 s×6次循環)、IPC－M組(頸總動脈5 min×3次循環)、遠隔缺血后處理(RIPC)組、延遲后處理(DIPC)組。實驗過程中動物飼養及取材均遵守實驗動物管理和保護有關規定。

1.2 主要試劑和儀器 2，3，5－三苯基氯化四唑(TTC)(美國Amresco公司)、兔多克隆抗RGMa抗體(英國Abcam公司)、免疫組化試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京中杉生物技術有限公司)、RNA提取液Trizol、RT－PCR反應試劑盒(大連寶生物工程有限公司)、焦碳酸二乙酯(DEPC)(美國Sigma公司)、逆轉錄聚合酶鏈反應(RT－PCR)引物合成(重慶升博生物技術公司)、PCR預混酶(天根生化科技有限公司)、凝膠掃描成像系統 ChemiDoc xRS(美國 Bio－Rad公司)、梯度 PCR儀(美國 Bio－Rad 公司)。

1.3 腦梗死模型及缺血后處理實施方案 大鼠用3.5%水合氯醛(1 ml/100 g)腹腔注射麻醉，根據Longa等〔2〕方法制作線栓法大腦I/R模型。IPC－S組:同時阻斷雙側頸總動脈血流10 s，恢復血流10 s，如此進行6次缺血/再灌注循環過程;IPCM組:雙頸總動脈5 min×3次循環;RIPC組:右股動脈5 min×3次循環;DIPC組:缺血24 h后雙頸總動脈5 min×3次循環。1.4 腦梗死體積測定 大鼠I/R 48 h后，腹腔注射3.5%水合氯醛深度麻醉并處死取腦。在大腦中動脈供血區域前后做2 mm厚連續冠狀切片5片，腦片置于2%TTC溶液中于37℃水箱避光孵育30 min，用0.1 mol/L磷酸緩沖溶液(PBS)沖洗2～3次，4%多聚甲醛緩沖液(PFA)固定。數碼相機拍照后使用Image－Pro Plus(IPP)6.0分析軟件 (美國 Media Cybernetics公司)計算腦梗死容積。

1.5 RT－PCR檢測不同 IPC組 RGMa mRNA表達 從 Gene Bank中找出RGMa和β－actin的基因序列，設計上、下游引物分別 為 5′－GCTGGATGGATGGGTATGGG－3′和 5′－GCCGCAGTGAGTGTAGTTGG－3′擴增片段長度 456 bp。β－actin 為內參對照其上、下游引物分別為 5′CGTAAAGACCTCTATGCCAACA－3′和 5′－CGGACTCATCGTACTCCTGCT－3′，擴增片段長度 229 bp。取各組缺血側大腦中動脈供血區皮質及海馬于液氮中保存。Trizol法提取總RNA，經逆轉錄及PCR反應，擴增產物5 μl在2%瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像儀下觀察并照相。用Quantity One(美國Bio－Rad公司)分析，以擴增后RGMa與β－actin電泳條帶平均光密度比值表示RGMa mRNA的相對表達量。

1.6 免疫組織化學檢測RGMa蛋白表達 大鼠過度麻醉后經心臟灌注PBS 200 ml和4%PFA 400 ml后立即斷頭取腦，放入4%PFA中固定，24 h后石蠟包埋，制作4 μm石蠟切片用作免疫組織化學觀察。在顯微鏡下觀察陽性細胞并拍照，用IPP 6.0分析軟件測量分析其光密度值。

2 結果

2.1 不同IPC對腦梗死體積的影響 假手術組腦片呈深紅色，無缺血區，再灌注后的其他組均可見明顯的呈白色不規則的梗死灶，I/R梗死體積百分比明顯升高(P＜0.01)。與I/R組比較，IPC－S組梗死體積百分比明顯降低(P＜0.01)，RIPC與IPC－M組也有不同程度降低(P＜0.05)，DIPC組梗死面積減少不明顯。見表1，圖1。

表1 各組大鼠腦梗死體積、缺血側及不同缺血后處理RGMa mRNA及蛋白表達比較(±s，n=15)

表1 各組大鼠腦梗死體積、缺血側及不同缺血后處理RGMa mRNA及蛋白表達比較(±s，n=15)

與假手術組相比:1)P＜0.01，2)P＜0.05;與I/R組相比:3)P＜0.01，4)P＜0.05

組別 假手術組 I/R組 IPC－S組 RIPC組 DIPC組 IPC－M組梗死體積(%) 0.00±0.00 33.14±6.151) 16.38±3.681)3) 25.64±4.911)3) 30.60±4.151) 26.82±4.291)4)皮質 0.31±0.06 0.70±0.171) 0.44±0.101)3) 0.51±0.101)4) 0.62±0.061) 0.53±0.121)4)海馬 0.34±0.05 0.63±0.041) 0.43±0.062)3) 0.51±0.081)3) 0.58±0.071) 0.53±0.031)3)

圖1 TTC染色檢測腦梗死體積

2.2 不同IPC對大鼠缺血側RGMa mRNA表達的影響 見表1，圖2，圖3。與假手術組相比，缺血MCAO/再灌注48 h后模型組和缺血IPC各組缺血側皮質RGMa mRNA的表達明顯增高(P＜0.01);各IPC組與MCAO/再灌注組比較顯示，除延遲后處理組外，各缺血后處理后缺血側皮質RGMa mRNA的表達均有不同程度減少(P＜0.01或P＜0.05)。

圖2 大鼠缺血皮質部位RGMa mRNA表達

圖3 大鼠缺血海馬部位RGMa mRNA表達

2.3 不同方式缺血處理對大鼠缺血側RGMa蛋白表達的影響在假手術組，皮質及海馬區域可見少量RGMa蛋白陽性表達，而缺血MCAO/再灌注后48 h時，在缺血側皮質及海馬均可見RGMa蛋白陽性表達明顯增高，與假手術組相比較有顯著性差異(P＜0.01);在給予IPC之后，RGMa蛋白的陽性表達水平明顯降低(P＜0.01)，但是仍未恢復到缺血前水平(P＜0.01)。見表 2，圖 4。

表2 各組大鼠缺血側RGMa蛋白表達(±s，n=15)

表2 各組大鼠缺血側RGMa蛋白表達(±s，n=15)

組別 假手術組 IR IPC－S組 RIPC組 DIPC組 IPC－M組皮質 0.34±0.08 0.77±0.081) 0.57±0.071)3) 0.67±0.041)3) 0.73±0.041) 0.69±0.041)2)海馬 0.30±0.05 0.73±0.051) 0.55±0.041)3) 0.60±0.071)3) 0.70±0.041) 0.67±0.041)2)

與假手術組相比:1)P＜0.01;與I/R組相比:2)P＜0.01;與I/R組相比:3)P＜0.05

圖4 不同缺血后處理后缺血側RGMa表達(×200)

3 討論

早期意義上的IPC是偶然發現的幾例心肌梗死的病人中，由于短暫的逐漸恢復冠狀動脈血供減少了后來發生的心房纖顫，研究人員逐漸開始關注這種方式的心臟保護作用〔3〕。相比缺血預處理在外科范圍的應用，IPC具有更廣泛的臨床上的可觀察、可操控性。本實驗設計的兩種不同時間的近端IPC，一種肢體遠隔后處理及一種延遲后處理方式，意義在于它們均可臨床中通過按、捆壓的方式實現，同時本文觀察了這幾種缺血后處理方式能夠實現的腦保護效果。

本研究發現在再灌注初期進行的夾閉雙側頸總動脈持續數秒至數分鐘的幾個循環均能起到減少腦梗死體積的作用，并且再灌注初期進行下肢的遠隔后處理每個循環數分鐘也能起到類似的效果。然而再灌注24 h后進行的IPC卻未能達到腦保護作用，這說明IPC存在治療時間窗的問題。Burda等〔4〕報道在腦缺血48 h后進行后處理發現能減少腦損傷，于是提出IPC的延遲治療時間在48 h內，但其所用的動物模型是全腦缺血模型，和本研究觀察的局灶性缺血模型不一致。而Ren等〔5〕研究使用MCAO在缺血3、6、12 h后進行后處理，發現6 h內進行后處理均有不同程度的腦保護效果，未有進行更長時間的嘗試。Pignataro等〔6〕在體外實驗也嘗試皮質神經元糖氧剝奪后10、30或60 min后處理只有10 min組具有神經保護作用，提出后處理的起始時間和處理時長對結果有重要影響。這與本實驗的結論基本一致。說明局灶性缺血模型的后處理治療時間窗還有待確定，至少并沒有全腦缺血模型中提到的那么樂觀。目前公認的還是只有早期的后處理才能達到理想的效果。

目前已知的可能參與IPC器官保護的機制包括減少自由基產生、改善內皮功能、保護血腦屏障的完整、減少炎癥、抑制凋亡通路以及減少活性氧(ROS)相關分子的激活〔1，6，7〕，RGMa 是近年來新發現的一種軸突導向分子，它與其受體Neogenin結合后導致生長錐塌陷，抑制軸突再生〔8～10〕。本研究提示RGMa在缺血的過程中被激活而可能參與IR損傷后神經損傷及修復，而IPC－S組神經損傷最少。結合目前國內外研究現狀，本研究認為IPC采用早期、短時程的多次循環是最佳策略，且方式可以是近端阻斷頸總動脈及遠端阻斷肢體大動脈血流等多種方式，其中在離缺血灶更近的血管實施可取得更好療效。IPC腦保護的分子機制可能與抑制RGMa及其受體結合，減少軸突損傷有關。

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2 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989;20(1):84－91.

3 Na HS，Kim YI，Yoon YW，et al.Ventricular premature beat－driven intermittent restoration of coronary blood flow reduces the incidence of reperfusion－induced ventricular fibrillation in a cat model of regional ischemia〔J〕.Am Heart J，1996;132(1 Pt 1):78－83.

4 Burda J，Danielisova V，Nemethova M，et al.Delayed postconditionig initiates additive mechanism necessary for survival of selectively vulnerable neurons after transient ischemia in rat brain〔J〕.Cell Mol Neurobiol，2006;26(7－8):1141－51.

5 Ren C，Gao X，Niu G，et al.Delayed postconditioning protects against focal ischemic brain injury in rats〔J〕.PLoS One，2008;3(12):e3851.

6 Pignataro G，Meller R，Inoue K，et al.In vivo and in vitro characterization of a novel neuroprotective strategy for stroke:ischemic postconditioning〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，2008;28(2):232－41.

7 Zhou Y，Fathali N，Lekic T，et al.Remote limb ischemic postconditioning protects against neonatal hypoxic－ischemic brain injury in rat pups by the opioid receptor/akt pathway〔J〕.Stroke，2011;42(2):439－44.

8 尹紅蕾，秦新月.RGMa及其在缺血性腦損傷后中樞神經再生中的作用〔J〕. 神經損傷與功能重建，2008;3(3):199－200.

9 Schnichels S，Heiduschka P，Julien S.Different spatial and temporal protein expressions of repulsive guidance molecule a and neogenin in the rat optic nerve after optic nerve crush with and without lens injury〔J〕.J Neurosci Res，2011;89(4):490－505.

10 Endo M，Yamashita T.Inactivation of Ras by p120GAP via focal adhesion kinase dephosphorylation mediates RGMa－induced growth cone collapse〔J〕.J Neurosci，2009;29(20):6649－62.