溶酶體蛋白酶cathepsin L在阿爾茨海默病模型大鼠海馬組織中的表達及意義

郭燕君 (嘉興學院醫學院，浙江 嘉興 314001)

人類cathepsin L基因定位于第9號染色體9q21-22，屬于半胱氨酸蛋白酶的家族成員之一，是一種廣泛存在的嗜酸性溶酶體蛋白水解酶。翻譯后N-端糖基化，利用6-磷酸-甘露糖受體而定位于溶酶體，并以酶原形式存在，其前體沒有活性，在受到刺激時可以被其他蛋白水解酶水解或者自身激活，其主要分布于溶酶體，也有極少部分定位于細胞核。在一定條件下會從溶酶體釋放到胞質，也會釋放到細胞外。有研究表明，在阿爾茨海默病(AD)患者的老年斑中，cathepsin L細胞外水平明顯升高〔1，2〕，溶酶體和細胞膜的不完整導致cathepsin L的異常定位在老齡相關疾病和AD的發病中起重要作用。cathepsin L在AD中的表達國內尚無報道。本研究通過建立β-淀粉樣蛋白(Aβ)大鼠海馬注射制作AD動物模型，觀察cathepsin L在AD大鼠腦組織中的表達，探討其在AD中的意義。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性Wistar大鼠，體重(230±20)g，由浙江省醫學科學院實驗動物中心提供。用Y-迷宮測試判定其空間辨別性學習記憶能力，淘汰反應過于遲鈍或特別敏感的大鼠，將選出的大鼠隨機分為正常組、假手術組和模型組，每組8只。

1.2 試劑和儀器 Aβ25～35(Sigma公司)、cathepsin L鼠抗單克隆抗體(Bio-Rad公司)、羊抗鼠標記的異硫氰酸熒光素(FITC)(北京中山生物技術公司)、Morris水迷宮(中國醫學科學院產品)、腦立體定位儀(NAR ISA IGE SN-2)。

1.3 模型制備 模型組大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.35 g/kg麻醉，頭部固定在腦立體定位儀上，剪毛消毒，在頭背中部縱向切口，暴露顱骨，定位坐標:雙側海馬區注射點(AP－3.5 mm，ML±2.0 mm，DV 2.7 mm)用微量進樣器(上海高欣玻璃儀器廠產品)注射 5 μl(10 μg)Aβ25～35(聚集態的 Aβ25～35形成)，10 min內注完。假手術組注射等量的生理鹽水。慶大霉素消毒，縫合皮膚。1 w后進行行為學檢測。假手術組除不注射 Aβ25～35外，其余步驟同模型組;正常組大鼠不做任何處理。

1.4 行為學檢測 模型制備7 d后，用Y-迷宮進行行為記憶觀察。對各組大鼠進行學習獲得能力次數測試和記憶再現次數測試。

1.5 標本的收集 行為測試后，大鼠用10%水合氯醛(0.35 g/kg)麻醉，并用4%多聚甲醛和0.1 mol/L磷酸緩沖液進行心臟灌流，之后取出大腦放入大鼠腦模具中進行冠狀切開，取各組相同斷面進行連續切片并進行免疫熒光染色。

1.6 HE染色 切片置于室溫下干燥30 min后，分別放入蘇木素和伊紅染液中進行染色。

1.7 cathepsin L免疫熒光染色 將腦片用振動切片機切成30 μm厚的切片，之后根據免疫熒光染色操作說明書進行染色。各組實驗均以不加第一抗體作陰性空白對照。cathepsin L陽性物質呈紅色熒光。

1.8 cathepsin L表達的檢測 隨機抽取各組大鼠5只麻醉后快速斷頭，在冰上取新鮮海馬組織，剪碎后加1∶10裂解液，勻漿，17 000 r/min 4℃離心1 h，取上清液用考馬思亮藍G250結合法測蛋白含量，根據已知牛血清白蛋白溶液的濃度及其吸光度和樣品吸光度計算樣品蛋白濃度。SDS-PAGE電泳:凝膠濃度為7.5%，電轉移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉TTBS緩沖液震蕩封閉3 h，將膜移入雜交袋中，加入用封閉液稀釋的1∶300 一抗 4℃ 過夜，β-actin(1∶300 購于 Santa Cruz公司)，洗膜。加入用封閉液稀釋的1∶500二抗(羊抗鼠IgG購于Santa Cruz公司)，室溫反應1 h，洗膜。洗膜后進行ECL(購于Santa Cruz公司)反應1～3 min。在暗室內曝光顯影后沖洗膠片，凝膠成像分析系統攝影分析。

1.9 圖像分析及統計學處理 將熒光顯微鏡下所攝cathepsin L陽性神經元照片用計算機圖像分析系統(HM IAS)記錄陽性細胞數和總細胞數，并記錄陽性細胞百分率;Western印跡檢測蛋白帶應用Metamorph圖像分析系統和Bio 2RAD Gel2000光密度掃描儀進行光密度掃描測定，計算整合光密度值(IDV)，計算出各組樣品目標帶與β-actin IDV比值。實驗數據用±s表示，采用SPSS12.0統計分析軟件進行單因素方差分析，顯著性檢驗用t檢驗。

2 結果

2.1 行為學改變 見表1。模型組大鼠的學習所需次數和記憶再現所需次數均長于正常組(P＜0.01)，而假手術組與正常組在學習所需次數和記憶再現所需次數上無明顯差異，說明Aβ25～35對學習記憶的獲得和記憶再現均有影響。

2.2 HE染色 AD組大鼠海馬注射針道附近可見細胞增生、聚集，核小深染，成扁圓形，判斷為膠質細胞。CA1區錐體細胞數量較對照組明顯減少，可見大量腫脹及圓齒形神經元，核邊聚、碎裂，成凋亡趨勢，局部神經元大段缺失，膠質細胞增生(圖1)。假手術組海馬神經元輕度受損(圖1)，與AD組比較有顯著差異。

表1 兩組行為學測試(n=8，±s)

表1 兩組行為學測試(n=8，±s)

與正常組比較:1)P＜0.01

組別 學習獲得能力次數 記憶再現次數正常組9.3 ±2.46 4.2 ±0.4模型組 26.7±5.11) 21.1 ±3.11)假手術組12.8±2.2 5.8 ±0.3

圖1 兩組大鼠海馬神經元(HE，×400)

2.3 cathepsin L蛋白熒光檢測 見表2、圖2。cathepsin L蛋白熒光檢測結果顯示，模型組大鼠在cathepsin L陽性神經元數量和陽性細胞百分率上均高于正常組大鼠(P＜0.05)。

表2 cathepsin L陽性神經元的表達(n=8，±s)

表2 cathepsin L陽性神經元的表達(n=8，±s)

與正常組比較:1)P＜0.05

組別 神經元數量 百分率(%)正常組7.4 ±2.1 15.9±1.17模型組 31.5±4.81) 34.6±0.951)假手術組9.6±5.3 16.9±0.64

圖2 大鼠海馬神經元cathepsin L蛋白表達(FITC，×400)

2.4 cathepsin L蛋白Western印跡檢測 見圖3。cathepsin L蛋白印記分析顯示，模型組大鼠的cathepsin L蛋白印記條帶DV值高于正常組〔(0.35±0.46)vs(0.14±0.02)，P＜0.01〕，而假手術組與正常組大鼠的cathepsin L蛋白印記條帶IDV值無明顯差異〔(0.14±0.02)，P＞0.05〕。

圖3 Cathepsin L蛋白Western印跡結果

3 討論

AD的病理特征是腦內神經元出現大量的老年斑(SP)。本研究采用Aβ25～35海馬內 CA1區注射造成Aβ沉積的AD模型，模型組大鼠的學習所需次數和記憶再現所需次數均長于正常組，模型組大鼠可見大鼠海馬注射針道附近可見細胞增生、聚集，核小深染，成扁圓形，判斷為膠質細胞。CA1區錐體細胞數量較對照組明顯減少，可見大量腫脹及圓齒形神經元，核邊聚、碎裂，成凋亡趨勢，局部神經元大段缺失，膠質細胞增生，在行為學和病理改變上證明模型是成功的。

cathepsin L的主要功能是降解和更新細胞內的蛋白，它在溶酶體降解蛋白的過程中發揮著重要作用，使細胞內的蛋白保持動態平衡，從而參與了機體很多正常的生理活動。研究證明其在神經遞質的加工處理〔3，4〕，抗原呈遞〔5〕、組織器官的發育等方面起著重要作用。近來研究證明，cathepsin L與神經退行性疾病，如AD密切相關。本研究發現AD大鼠海馬區cathepsin L陽性神經元數量明顯增加，提示cathepsin L的表達水平升高與海馬神經元退行性變有關。已經有研究證明cathepsin L參與了caspase-3的激活〔6〕，并對神經元的凋亡具有調節作用，但是參與的詳細機制仍不明確。

cathepsin L參與海馬神經元死亡的可能機制是，cathepsin L參與了小膠質細胞激活所誘發的炎癥反應，炎癥反應在神經退行性疾病中作用一直受到重視。研究已證實用刺激小膠質細胞，cathepsin L表達升高，且參與了小膠質細胞介導的神經元的死亡過程〔2〕?？梢?，溶酶體蛋白酶cathepsin L的表達、分部及活性的改變既可以在神經元內參與凋亡，還可以在小膠質細胞的激活過程中發揮作用，其在AD中的具體作用及機制還有待于進一步探討。

1 Nakanishi H.Neuronal and microglial cathepsins in aging and age related diseases〔J〕.Ageing Res Rev，2003;2(4):367-81.

2 Gan L，Ye S，Chu A，et al.Identification of cathepsin B as a mediator of neuronal death induced by A beta-activated microglial cells using a functional genomic approach〔J〕.J Biol Chem，2004;279(7):5565-72.

3 Hook VY.Unique neuronal functions of cathepsin L and cathepsin B in secretory vesicles:biosynthesis of peptides in neurotransmission and neurodegenerative disease〔J〕.Biol Chem，2006;387(10-11):1429-39.

4 Funkelstein L，Toneff T，Hwang SR，et al.Cathepsin L participates in the production of neuropeptide Y in secretory vesicles，demonstrated bu protease gene knockout and expression〔J〕.J Neurochem，2008;106(1):384-91.

5 Hsing LC，Rudensky AY.The lysosomal cysteine proteases in MHC class II antigen presentation〔J〕.Immunol Rev，2005;207:229-41.

6 Ishisaka R，Utsumi T，Kanno T，et al.Participation of a cathepsin L-type protease in the activation of caspase-3〔J〕.Cell Struct Funct，1999;24(6):465-70.