分枝桿菌噬菌體D29與巨噬細胞的相互作用及其機制

張紅梅，梁 梅，劉 平，烏亭亭，郭述良

(重慶醫科大學附屬第一醫院呼吸內科，重慶400016)

目前結核疫情和耐藥形勢仍十分嚴峻，已有40多年沒有突破性的抗結核藥物問世，急需開發治療結核病的新藥物、新技術和新方法。由于噬菌體能夠特異性裂解宿主菌，金黃色葡萄球菌噬菌體、銅綠假單胞菌噬菌體等多種噬菌體已用于臨床試驗。面對日趨嚴峻的結核疫情，分枝桿菌噬菌體D29因能特異性裂解結核菌而成為研究熱點，國家“十一五”重大專項課題已經給予支持，該課題前期研究顯示：分枝桿菌噬菌體D29不僅能裂解巨噬細胞外的結核菌，且能裂解巨噬細胞內的結核菌。但D29是如何進入巨噬細胞內，進入巨噬細胞后又是如何進入巨噬細胞內的結核菌內以及D29在巨噬細胞內結核菌內外分布的滴度變化是本文作者關注的問題，目前尚無相關文獻報道。本研究通過探討分枝桿菌噬菌體D29是否會影響巨噬細胞的免疫功能及D29被巨噬細胞吞噬后在結核菌內外的滴度變化，旨在為研究D29用于治療結核病的機制及臨床治療劑量的確定提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、動物、主要儀器和試劑

分枝桿菌噬菌體D29及恥垢分枝桿菌由本室培養，H37RV結核標準株來自重慶市肺科醫院。恥垢分枝桿菌、H37RV結核標準株分別在改良羅氏培養基上37℃培養3～7 d和2～4周，分枝桿菌噬菌體D29的擴增和效價檢測方法見參考文獻[1-2]，純化方法見參考文獻[3]，4℃保存。7～8周齡SPF級BALB/C小鼠，購自重慶醫科大學實驗動物中心。5%CO2培養箱(Thermo Scientific公司)；6孔、12孔培養板；平皿(Greiner公司)；倒置顯微鏡(OLYMPUS)；低速水平離心機(長沙平凡儀器儀表公司)；超速低溫離心機(Sigma 公司)；PCR儀(TaKaRa Code.TP800)；酶標儀；恒溫水浴箱(金壇市金偉實驗儀器)；引物：5′-AGCTGGCCGGTACGACTCAG-3′，5′-GAGTCAACACCACGGCGGT-3′(TaKaRa)。胎牛血清(FBS，Hyclone公司)；RPMI 1640(Hyclone公司)；硫酸亞鐵銨(FAS，Sigma公司)； 7H9培養基、7H10培養基(BD公司)；牛血清復合物(OADC，BD公司)；IL-12 ELISA試劑盒(達科為生物技術有限公司)；NO ELISA試劑盒(R&B公司)。SYBR Premix Ex Taq Ⅱ、DL 2 000 DNA Marker、pMD 18-T Vector、細菌基因組提取試劑盒、病毒RNA/DNA提取試劑盒均為TaKaRa公司產品。

1.2 腹腔巨噬細胞的提取和純化[4]

1.2.1 巨噬細胞的提取 小鼠腹腔注射巰乙酸酯肉湯1 mL，72 h后采用頸椎脫臼法處死。75%酒精浸泡7 min后，腹腔注射PBS 4 mL/只，輕揉腹部2 min后，在無菌條件下用解剖剪和解剖鑷逐層打開腹腔，回收透明的腹腔液。腹腔液1 000 r· min-1離心7 min，重懸后再用RPMI 1640液洗滌2次，最后加入RPMI 1640(10%FBS)制成細胞懸液。采用臺盼藍拒染法對細胞懸液進行細胞計數。

1.2.2 細胞計數 在細胞板上采用臺盼藍拒染法對細胞懸液進行細胞計數。公式為：細胞計數(mL-1)=(4個大格子細胞總數/4)×104×稀釋倍數。根據細胞懸液的濃度用RPMI 1640(10%FBS)調整至5×105mL-1，作為工作濃度。

1.2.3 巨噬細胞的純化 將工作濃度的細胞懸液加入6孔細胞板中，每孔l mL，37℃、5%CO2飽和濕度條件下孵育3 h，使巨噬細胞貼壁，棄去未貼壁細胞，即得到純化的巨噬細胞。

1.3 巨噬細胞的吞噬作用

1.3.1 巨噬細胞對分枝桿菌噬菌體D29的吞噬 純化的巨噬細胞(5×105個/孔)中每孔加入100 μL分枝桿菌噬菌體D29(1×108PFU)，分別于5、10、15、20和25 min時加入8%FAS 100 μL，作用5 min以殺滅未進入巨噬細胞的D29，棄去上清，PBS沖洗3次，最后加入phage buffer 1 mL，采用反復凍融[5]的方法使巨噬細胞裂解，收集孔內所有裂解液，10 000 r·min-1離心10 min，收集上清液于離心管中，采用小平皿法鋪板測定所有離心管中D29效價，每個時間點3個復孔。同時設置對照組，孔內不加巨噬細胞，以證明8%FAS作用5 min是否能將巨噬細胞外D29全部殺滅。另設D29組，效價1.4×107PFU·mL-1，用phage buffer 10×梯度稀釋至1.4×102PFU·mL-1，每個稀釋度的D29液經過反復凍融后，小平皿法測定效價，以證明經反復凍融后D29效價下降程度。

1.3.2 巨噬細胞對結核分枝桿菌標準株(H37RV)的吞噬 ①H37RV單細胞懸液的制備：將在改良L-J培養基上37℃生長3～4周的結核分枝桿菌菌落用7H9液體培養基洗下后研磨，用8 μm濾器過濾，麥氏比濁法測定菌液濃度，調整濃度至1 g·L-1，即得到H37RV單細胞懸液，作為巨噬細胞吞噬H37RV的工作濃度。②巨噬細胞對H37RV的吞噬：純化的巨噬細胞(5×105個/孔)中每孔加H37RV單細胞懸液1 mL，37℃、5%CO2孵育4 h，棄去培養液，每孔加37℃的PBS(pH 7.0)2 mL，采用不離心方法洗滌3次，以去除游離的巨噬細胞和未被吞噬的H37RV。同時設無細胞對照孔以證實洗滌3次是否能將未被吞噬的菌落洗脫。

1.4 分枝桿菌噬菌體D29在巨噬細胞內的變化

分別將1×108PFU和1×107PFU的D29加入到純化的巨噬細胞內(5×105個/孔)，于20 min后用FAS殺滅細胞外的D29，分別于0、10、20和30 min反復凍融裂解巨噬細胞，收集所有液體于離心管，10 000 r· min-1離心10 min，平皿法鋪板測定效價，每個時間點3個復孔。

1.5 分枝桿菌噬菌體D29對巨噬細胞的影響

純化的巨噬細胞分為3組(一塊24孔板，每6孔為一組)，分別為：①巨噬細胞空白對照組；②巨噬細胞+LPS組，加入LPS使其終濃度為10 mg·L-1，為陽性對照；③巨噬細胞+D29組，將1×108PFU的D29加入巨噬細胞孔內，于20 min時FAS殺滅PBS緩沖液沖洗后，加入RPMI 1640培養基2 mL/孔，繼續培養細胞12 h后分別吸取3組中每孔的培養上清液，每組均獲取6個樣品，ELISA法分別檢測IL-12與NO含量。標準曲線的建立及細胞上清液IL-12與NO的檢測嚴格按說明書進行操作。

1.6 分枝桿菌噬菌體D29進入巨噬細胞中結核菌的時間

工作濃度的H37RV單細胞懸液1 mL/孔加入純化的巨噬細胞中，37℃、5%CO2孵育4 h，棄去培養液，每孔加37℃的 PBS 2 mL洗滌3次，D29(1×109PFU·mL-1)100 μL/孔加入巨噬細胞，20 min后殺滅未進入巨噬細胞的D29，分別于0、10、20、30、40和200 min裂解巨噬細胞[6]，待巨噬細胞完全裂解后，加入8%FAS殺滅未進入結核菌的D29，10 000 r·min-1離心10 min，用沉淀鋪板，觀察噬菌斑出現時間。同時設2孔對照，巨噬細胞中不加結核菌，以證明FAS能否殺滅巨噬細胞內所有D29。

1.7 分枝桿菌噬菌體D29在巨噬細胞中結核菌內外的滴度變化

1.7.1 結核菌外的滴度變化 工作濃度的H37RV單細胞懸液1 mL/孔加入純化的巨噬細胞中，37℃、5%CO2孵育4 h，棄去培養液，每孔加37℃的PBS 2 mL洗滌3次，1×109、1×108PFU D29分別加入巨噬細胞中，分別于30、40、50、60、190、210 min和48 h后棄上清，裂解巨噬細胞，10 000 r·min-1離心，收集上清液提取DNA(按照說明書操作)，行熒光定量PCR檢測。①構建DNA標準品：將片段序列為430 bp的目的基因片段克隆到pMD18-T Vector上，經純化、線性化質粒，經抽提得標準品。②引物序列：5′-AGCTGGCCGGTACGACTCAG-3′，5′-GAGTCAACA-CCACGGCGGT-3′。③標準曲線制作：將DNA標準品梯度稀釋(1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102及10 copies· μL-1)作為模板進行Real Time PCR反應，反應組成為SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μL，Primer F/R mix 1 μL，Template 1 μL，dH2O 9.5 μL；反應條件為95℃、30 s，95℃、5 s,60℃、30 s，后兩步進行45個循環，得標準曲線。④樣品檢測：每個樣品復測1次，反應組成及條件均按步驟③操作。

1.7.2 結核菌內的滴度變化 將1.7.1中10 000 r·min-1離心后的沉淀提取DNA(按照細菌基因組提取試劑盒)，做熒光定量PCR檢測，步驟如1.7.1中所述。

1.8 統計學分析

2 結 果

2.1 巨噬細胞對分枝桿菌噬菌體D29的吞噬情況

各個效價的D29液在反復凍融前后平皿法測得效價見表1。巨噬細胞在加入D29不同時間，裂解細胞后平皿法所得D29滴度見表2。無巨噬細胞的對照孔在加入8%FAS作用5 min后無噬菌斑出現，說明8%FAS 100 μL作用5 min可使巨噬細胞外的所有D29失活。表1顯示：不同效價D29經過反復凍融后，滴度比較差異無統計學意義(P>0.05)；表2顯示：隨著作用時間延長，巨噬細胞吞噬的D29量(鋪板法)隨之增加，在作用20 min時吞噬量多，與25 min時相比雖有下降，但差異無統計學意義(P>0.05)，因此在觀察D29與巨噬細胞相互作用時感染時間選擇20 min為宜。

表1 不同效價D29液在反復凍融前后效價比較

表2 與巨噬細胞作用不同時間后D29進入巨噬細胞的數量

2.2 分枝桿菌噬菌體D29在巨噬細胞內的滴度變化

1×108及1×107PFU D29與巨噬細胞共同孵育20 min后，經反復凍融法(約160 min)后鋪板測D29效價，均有約104PFU的D29被巨噬細胞吞噬，進入巨噬細胞約170 min后D29存活量即開始減少，180 min后大量失活，差異有統計學意義(P<0.05)，190 min時巨噬細胞內已無存活的D29。見表3。

2.3 分枝桿菌噬菌體D29對巨噬細胞免疫功能的影響

D29被巨噬細胞吞噬后，上清液中IL-12和NO水平與巨噬細胞空白組比較差異無統計學意義，但明顯少于LPS陽性對照組(P<0.05)。見表4。

表3 D29進入巨噬細胞不同時間后存活量比較

表4 巨噬細胞上清液IL-12和NO水平

2.4 分枝桿菌噬菌體D29進入巨噬細胞中結核菌內的時間

結核菌被巨噬細胞吞噬后，1×109PFU·mL-1D29以100 μL/孔加入巨噬細胞，孵育20 min后殺滅未進入巨噬細胞的D29，即刻裂解巨噬細胞并加入8%FAS后，離心用沉淀鋪板未見噬菌斑，10 min時裂解巨噬細胞可見17個噬菌斑，20 min時可見20個噬菌斑，30 min時可見25個噬菌斑，40 min時可見75個噬菌斑，200 min時可見60個噬菌斑(圖1)。未加結核菌的對照組于10 min裂解巨噬細胞后無噬菌斑出現，說明FAS能殺滅巨噬細胞內所有D29。

2.5 熒光定量PCR檢測分枝桿菌噬菌體D29在巨噬細胞中結核菌內外的滴度變化

加入1×109及1×108PFU D29于巨噬細胞中，作用40、50 min時，D29在結核菌內外滴度均有一過性升高，此后結核菌內外滴度均下降，作用190、210 min時D29量大幅度減少，48 h時結核菌內外幾乎不能檢測到D29(圖中未給予表示)。見圖2和3。

3 討 論

隨著耐藥結核的出現，噬菌體療法顯得尤為重要，但結核分枝桿菌屬于胞內寄生菌，D29進入巨噬細胞后是否會被巨噬細胞殺滅、是否會影響巨噬細胞的免疫功能、進入巨噬細胞后在結核菌內外的滴度變化對于確定D29用于治療結核病的給藥劑量尤為重要。D29被巨噬細胞吞噬后很快失活，但當巨噬細胞內存在結核菌時，D29存活時間延長，提示當D29用于治療時可選擇無致病性的恥垢分枝桿菌或母牛分枝桿菌作為載體，可能會延長D29在巨噬細胞內的存活時間，從而更好地發揮裂解胞內結核菌的作用。有研究[7]表明：將大腸桿菌和T4噬菌體預先共培養15 min后再與中性粒細胞混合，可增強中性粒細胞吞噬大腸桿菌的能力。這說明本文作者選用恥垢分枝桿菌或是母牛分枝桿菌作為載體，可能會增強巨噬細胞對其載體的吞噬能力，從而會有更多的D29到達靶細胞發揮裂解作用，這對治療胞內結核菌的感染有很大益處。

圖1 D29在不同時間進入巨噬細胞中結核菌內的數量

圖2 標準曲線

圖3 D29被巨噬細胞吞噬后分布于結核菌內外的滴度變化

結核病發病時表現為Th1免疫應答受抑制和(或)Th2應答亢進，IL-12是一種異源二聚體的細胞因子，能誘導初始T細胞分化為Th1細胞，并促進Th1增殖，有可能調節機體的抗結核免疫。NO是一種多功能的信息分子，可在巨噬細胞發揮細胞毒性作用、免疫調節作用以及胞內殺菌作用等。本研究結果顯示：D29被巨噬細胞吞噬后，細胞上清液中IL-12及NO水平與空白對照組比較差異無統計學意義，說明D29不會影響巨噬細胞的免疫功能。而Eriksson等[8]研究顯示：噬菌體可增加小鼠脾細胞培養上清液中IL-12水平。這可能與本研究所用噬菌體株不同及脾組織中含有較多淋巴細胞有關。

Rosanna等[9]證實：phage MSa能夠減少甚至殺滅小鼠巨噬細胞內的金黃色葡萄球菌；彭麗等[4]也證實：D29進入巨噬細胞后可以減少巨噬細胞內的活菌數量。本研究證實了D29進入巨噬細胞后，能吸附并感染結核菌，通過在其中復制、增殖殺滅結核菌，但D29感染效率不高，這可能與胞內弱酸環境影響D29的吸附有關[10]。在本研究中，D29與吞噬了結核菌的巨噬細胞孵育40和50 min時，D29在結核菌內外滴度均有一過性升高，這可能有兩方面原因：①隨著時間延長，進入巨噬細胞內的D29增多，進入結核菌的D29量也增多；②隨著D29進入結核菌，其DNA在其中開始復制、增殖，這可以用David等[11]的研究結果解釋：DNA在結核菌內復制開始于感染后20 min，10 min后復制1代。但是此后結核菌內外滴度均下降，孵育190、210 min時D29量大幅度減少，48 h時結核菌內外幾乎不能檢測到D29，分析原因可能是由于巨噬細胞對其殺傷作用大，D29從結核菌內釋放出來后未能感染其他結核菌就被溶酶體消化了，提示在用D29治療結核病時可能需要多次給藥。但也有可能是因為結核菌長期處在D29的環境里發生了變異，使其對D29產生抗性，因而D29不能吸附并進入結核菌而長期暴露在巨噬細胞中被消化，具體原因還有待下一步證實。

本研究中擴增D29最大滴度為1×109PFU·mL-1，所以在使用劑量上受到了很大限制，根據本研究結果，D29滴度越高，進入巨噬細胞中及巨噬細胞中結核菌內的數量越多，且D29不會影響巨噬細胞的免疫功能，如果D29用于治療結核病，臨床上可考慮使用較大劑量。

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