2，4-D和6-BA對高羊茅愈傷組織誘導的影響

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(湖南農業大學農學院，長沙 410128)

2012-10-16

武羿君(1988—)，女，內蒙古呼和浩特人。*通訊作者，Email：huxu0309@yahoo.com.cn。

湖南農業大學大學生研究性學習和創新性實驗計劃項目(XCX1019)；中國科學院植物種質創新與特色農業重點實驗室開放課題(Y052811t04)；湖南省教育廳項目(KC2011B023)。

2，4-D和6-BA對高羊茅愈傷組織誘導的影響

武羿君，徐慶國*

(湖南農業大學農學院，長沙 410128)

以高羊茅成熟種子為外植體，采用MS 基本培養基，研究了不同濃度的2,4-D和6-BA對其愈傷組織誘導的影響。結果表明：不同濃度2,4-D對高羊茅愈傷組織誘導率差異顯著，以9 mg/ L效果最好，濃度過高，愈傷組織誘導率下降；在0～0.8 mg/ L范圍內，高羊茅愈傷組織誘導率隨6-BA 濃度的增加而增大，當濃度為0.6 mg/L時誘導效果最好。

高羊茅；組織培養；愈傷組織；2,4-二氯苯氧乙酸；6-芐氨基嘌呤

高羊茅又稱葦狀羊茅，禾本科羊茅屬，原產歐洲西部，具有較高的營養價值，是溫帶地區建立人工草地和補播天然草場的重要草種[1]。高羊茅屬多年生冷季型草種，具有抗干旱、耐瘠薄、抗病性強、耐粗放管理、適應性廣及綠期長、觀賞性高等特點，因此，廣泛應用于世界各國的綠地建設和水土保持等各類草坪中[2]。高羊茅作為一種重要草種，不僅廣泛應用于內蒙古、新疆、甘肅、黑龍江等我國北方省市的牧場草地和綠化草坪建植中，在我國南方草坪過渡性地帶的常綠草坪建植中也發揮著重大作用，是我國目前較為常用的冷季型草坪草種之一[3～5]。

國外發達國家對草坪草育種的研究歷史較長，早已開展了對高羊茅的轉基因研究，并獲得了轉基因工程植株，實現了對高羊茅性狀的定向改良[6]。國內對草坪草植株再生體系的研究開展較晚，直到20世紀90年代隨著草坪業的快速發展才得以起步研究。與其他重要的禾本科作物相比，國內關于高羊茅的組織培養研究遠遠落后，而成功建立高羊茅再生植株的報道更為少見[7]。國內雖然也對高羊茅的組織培養和轉基因進行了一些研究，但其研究深度和廣度還遠遠不夠。一般認為愈傷組織是轉基因的理想受體，要對草坪草進行遺傳轉化，首先要建立其愈傷組織再生體系，而愈傷組織的誘導是建立再生體系的前提和基礎[8～10]。國內對高羊茅愈傷組織的誘導曾有不少研究，認為不同濃度的2,4-D和6-BA對高羊茅愈傷組織誘導有重要影響，對高羊茅再生體系的建立和轉基因育種具有十分重要的意義。本研究選取不同品種高羊茅成熟種子為外植體，研究不同濃度的2，4-D和6-BA對高羊茅愈傷組織誘導的影響，試圖找到能產生高羊茅愈傷組織高出愈率的2,4-D和6-BA最佳濃度，建立適宜的高羊茅再生體系，為高羊茅的轉基因育種建立基礎和提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試高羊茅品種

北京百綠(天津)國際草業有限公提供的3個高羊茅(Festucaarundinacea)品種：交戰Ⅱ(Crossfire Ⅱ)、貝克(Baker)、獵狗(Hound)。

1.2 外植體處理方法

分別取各供試高羊茅品種成熟種子，在50 %的硫酸中浸泡30 min，脫去穎殼后用清水洗凈，去掉雜質，再用清水浸泡12 h，清水沖洗后置于4℃環境下備用。

1.3 試驗方法

按MS配方配置MS培養基作為本研究的基本培養基。在MS基本培養基中分別加入不同濃度的6-BA和2,4-D，各種處理培養基pH值均調至5.8，分別設置如下2種不同激素濃度的單因素試驗。

(1)在MS培養基中分別加入不同濃度的2,4-D，作為高羊茅愈傷組織的誘導培養基。2,4-D 濃度分別為0、3、6、9和12 mg/L，以未加2,4-D的MS培養基為對照。每種處理分別接種30粒不同高羊茅品種種子，每個培養基組合設置3個重復，共計5組，每組9個處理。

(2)在MS培養基中分別加入不同濃度的6-BA，作為3個高羊茅品種愈傷組織的誘導培養基。6-BA濃度分別為0、0.2、0.4、0.6和0.8 mg/L，以未加6-BA的MS培養基為對照。每種處理分別接種30粒不同高羊茅品種種子，每個培養基組合設置3個重復，共計5組，每組9個處理。

1.4 接種

在超凈工作臺上，將已經過處理的高羊茅種子分別用70%的酒精消毒30～40 s， 用無菌水沖洗3～5次，再用0.1%升汞(氯化汞)溶液處理3～4 min后用無菌水沖洗4～5次。將經過消毒處理的3個不同高羊茅品種的種子接種到不同培養基組合，置于25～26℃，暗培養條件下進行愈傷組織誘導培養。

1.5 愈傷組織觀察及記錄

不同品種的高羊茅種子接種7 d后開始統計不同處理組合的發芽率、出愈率，每隔5 d統計1次。按如下公式統計各處理的發芽率、出愈率：

發芽率(%)=發芽種子數/接種數×100

出愈率(%)=不再變化后愈傷數/接種數×100

1.6 數據統計與分析

本研究所有統計分析工作采用Excel統計分析軟件進行。

2 結果與分析

2.1 不同2,4-D濃度對高羊茅愈傷組織誘導的影響

由表1可知，不同濃度的2,4-D對高羊茅的發芽率影響不顯著，且高羊茅的發芽率對其愈傷組織的出愈率影響也不明顯。最終發芽率的統計結果表明，不同高羊茅品種的發芽率與2,4-D的濃度不存在顯著相關，與其出愈率的相關也未達顯著水平。

不同2,4-D濃度培養基接種的高羊茅種子在暗培養7 d后，大部分種子在芽鞘和種子連接處產生了白色水浸狀、柔軟松散的物質；在連續培養20 d后，愈傷組織的顏色由白色透明轉變為半透明淡黃色。40 d后統計不同處理的愈傷組織誘導結果，表明不同濃度的2,4-D對高羊茅愈傷組織的誘導率影響不同。在5種2,4-D處理濃度中，處理濃度為9 mg/L的出愈率為43%，極顯著高于其他處理濃度的出愈率；2,4-D濃度為6 mg/L的出愈率極顯著高于濃度為3 mg/L和12 mg/L的出愈率(表1)。由此可知，在一定的濃度范圍內，2,4-D能夠提高高羊茅愈傷組織的出愈率，但濃度過高反而會降低高羊茅愈傷組織的出愈率，其中以添加2,4-D 9 mg/L的MS培養基對高羊茅成熟種子的愈傷組織誘導效果最好。

表1 不同2，4-D濃度處理的高羊茅種子發芽率與出愈率

注：表中同列數據不同小寫字母表示α= 0. 05 水平上差異顯著，不同大寫字母表示α= 0. 01 水平上差異極顯著。下同。

2.2 不同6-BA濃度對高羊茅愈傷組織誘導的影響

經過消毒處理的高羊茅種子在配有不同濃度6-BA的培養基上暗培養7 d后，開始發芽。由表2可以看出，不同濃度的6-BA對高羊茅的發芽率影響不明顯，并且高羊茅的發芽率對其愈傷組織誘導的影響差異也未達顯著水平。最終統計結果表明，高羊茅的發芽率與6-BA的濃度和出愈率均未達顯著水平的相關。

不同6-BA濃度培養基接種的高羊茅外植體暗培養7 d后，大部分高羊茅種子在芽鞘和種子連接處產生了白色水浸狀、柔軟松散的物質；20 d后開始出現淡黃色的愈傷組織。40 d后統計不同處理的愈傷組織誘導結果，不同濃度的6-BA處理，其高羊茅愈傷組織的誘導率不同。在5種6-BA處理濃度中，濃度0.8 mg/L的出愈率為23.3%，極顯著高于其他處理濃度的出愈率；濃度為0.6 mg/L的出愈率極顯著高于濃度為0.2 mg/L和0.4 mg/L的出愈率(表2)。由此說明，當6-BA在一定范圍濃度內，隨著6-BA濃度的增加，高羊茅愈傷組織的誘導率也隨之增加。

表2 不同6-BA濃度的高羊茅種子發芽率與出愈率

3.3 不同高羊茅品種對愈傷組織誘導的影響

從表3和表4可知，不同高羊茅品種在不同2，4-D濃度和不同6-BA培養基接種后的發芽率差異均未達顯著水平。以獵狗5號的發芽率最高，但其出愈率卻不是最高的，由此表明高羊茅品種的發芽率與其出愈率不存在顯著相關，但是，不同高羊茅品種對其愈傷組織的誘導率存在明顯基因型差異。由表3可知，不同高羊茅品種種子在2,4-D培養基中的愈傷組織的誘導率不同，交戰Ⅱ的出愈率為28.4%，極顯著高于其他2個高羊茅品種；而獵狗5號和貝克的出愈率差異未達顯著水平。

表3 不同高羊茅品種在2，4-D培養基中的平均發芽率與出愈率

從表4可以看出，不同高羊茅品種種子在6-BA培養基中的愈傷組織的誘導率不同，獵狗5號的愈傷組織出愈率為16%，極顯著高于其他2個高羊茅品種。同一高羊茅品種種子在不同激素作用下的出愈率不同。如貝克在不同濃度2,4-D和不同濃度6-BA培養基接種后的發芽率幾乎沒有變化，但其平均出愈率卻相差12.5個百分點。

表4 不同高羊茅品種在6-BA培養基中的平均發芽率與出愈率

3 討論

3.1 不同2,4-D和6-BA濃度對高羊茅愈傷組織誘導的影響

本研究采用獵狗、交戰Ⅱ和貝克等3個高羊茅品種的成熟種子為外植體，進行了不同濃度2,4-D和不同濃度6-BA培養基的高羊茅愈傷組織誘導研究。結果表明，植物生長素2,4-D對該3個高羊茅品種愈傷組織的誘導有明顯的促進作用。當2，4-D濃度在0～9 mg/L范圍內，隨著2,4-D濃度的增加，其愈傷組織的誘導率升高；但當2,4-D濃度增高到一定程度(9 mg/L)后，其誘導率呈下降趨勢。郎春秀等[3]研究發現，2,4-D對高羊茅愈傷組織誘導的最佳濃度為8 mg/L，而高麗美等[11]試驗結果顯示，2,4-D誘導高羊茅成熟種子的最佳濃度是9 mg/L，這與本試驗研究的結果基本吻合。

本研究表明，當6-BA濃度在0～0.8 mg/L范圍內，隨著6-BA濃度的增加，高羊茅愈傷組織的誘導率也隨之有升高的趨勢；當6-BA濃度增加到0.8 mg/L時，雖然高羊茅的愈傷組織誘導率升高，但其長勢卻變差，愈傷組織不透明、硬實，生長緩慢，最后轉變為暗黃色，利用價值低。本研究只研究了一定濃度6-BA對不同高羊茅品種愈傷組織誘導率的影響，今后還可以在此基礎上繼續研究不同濃度6-BA對高羊茅愈傷組織分化的影響，進而獲得最佳的促進高羊茅愈傷組織誘導的6-BA濃度。

本研究采用了3個不同高羊茅品種的成熟種子為外植體，結果發現，在MS培養基上添加6～9 mg/L 2,4-D和0.4～0.6 mg/L 6-BA對高羊茅愈傷組織的誘導都有較大的促進作用。而此前劉衛東等的研究認為，不同種類的基本培養基對愈傷組織誘導沒有顯著差異。易自力等[13]通過比較NB、MS和CC 3種植物組織培養常用的基本培養基，認為進行高羊茅成熟種子愈傷組織誘導宜采用CC培養基。何陽鵬等[14]通過試驗發現BA對愈傷組織的誘導存在一定濃度的負效應，在培養基中添加的BA濃度越高，愈傷誘導率越受抑制。為了進一步提高高羊茅種子愈傷組織的誘導率，今后可選用多種植物生長素和植物細胞分裂素濃度配比及其添加其他生物活性物質進行試驗，從而獲得最佳植物激素組合的培養基。

3.2 不同基因型對高羊茅愈傷組織誘導的影響

本研究采用了湖南等我國草坪過渡帶地區常用的3個高羊茅品種進行不同濃度的2,4-D和不同濃度6-BA培養基的愈傷組織誘導研究，結果表明，3個供試高羊茅品種成熟種子愈傷組織誘導率存在一定的基因型差異。如在不同2,4-D濃度培養基誘導高羊茅愈傷組織的試驗中，3個高羊茅品種的發芽率相似，但平均出愈率卻相差甚大，其中，交戰Ⅱ的平均出愈率為28.4%，極顯著高于其他2個高羊茅品種的出愈率。高羊茅組織培養的基因型差異在以往已有相關報道。如：Bai和Qu[15]的研究表明，在25個供試品種中，愈傷組織誘導率相差達數倍甚至10倍以上。郎春秀等[3]在研究中發現，當2,4-D濃度為8 mg/L、ABA濃度為2 mg/L時，高羊茅可奇思的愈傷組織誘導率高出獵狗5號13.4個百分點。吳關庭等[16]通過試驗發現，在BAP與KT配比、NAA濃度和瓊脂濃度試驗中，各自適宜濃度條件下，高羊茅獵狗5號的總愈傷組織再生率比美洲虎3號高23.8～29.3個百分點。余桂紅等[5]以5個高羊茅品種成熟種子為外植體，研究表明，不同高羊茅品種成熟種子在相同培養基上的出芽率和出愈率差異很大。這些結果表明，在今后有關高羊茅愈傷組織培養的研究中，應針對不同高羊茅品種選擇相適宜的激素濃度，以達到最佳誘導效果。并且在此基礎上，進一步研究不同激素種類及濃度對高羊茅愈傷組織誘導的影響，最終實現湖南本地高羊茅草種的抗熱性改良，實現高羊茅在湖南等草坪草過渡性地帶的四季常綠。

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1001-5280(2012)07-0021-04

10.3969/j.issn.1001-5280.2012.07.06