缺血/再灌注損傷時細胞周期調控的研究進展

杜秋國，高建虎，徐志廣(綜述)，盧綺萍(審校)

(1.廣州軍區武漢總醫院普外科，武漢430070;2.南方醫科大學，廣州510515)

缺血/再灌注損傷(ischemic reperfusion injury，IRI)是指組織或器官缺血及重獲血流灌注或氧供應后，對組織或器官所產生的損傷作用［1］。細胞的正確增殖需要通過細胞周期的調控，細胞在分裂時必須獲得生存所需物質，特別是遺傳物質，而IRI與細胞周期的調控有著千絲萬縷的關系。因此，文中將對IRI時的細胞周期調控進行綜述。

1 細胞周期概述

細胞周期是指連續分裂的細胞從上一次有絲分裂結束到下一次有絲分裂完成所經歷的整個過程，一般可分為5期:G0期(靜息期)、G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)、M期(有絲分裂期)，包含兩個主要檢驗點，即G1/S檢驗點(DNA合成起始轉換點)和G2/M檢驗點(有絲分裂誘導轉換點)，通過檢驗點后，即使刺激信號被去除，細胞仍然會開始DNA復制［2］。其中以G1/S檢驗點最為重要，在G1期發揮作用的主要是CDK4-cyclin D和CDK6-cyclin D［3］。細胞周期是多階段、多因子參與的精確而有序的調控過程［2］。細胞周期的調控可分為外源性和內源性調控，外源性調控主要是由外界刺激引起的，而內源性調控主要是通過對細胞周期蛋白、細胞周期蛋白依賴性激酶、細胞周期依賴性激酶抑制因子(cyclin-kinase inhibitor，CKI)三者的調控來實現［3-4］。

細胞周期蛋白是調節細胞周期活動的重要蛋白質，它對整個正常細胞周期的維持起決定性作用［5］。在哺乳動物細胞中存在12類cyclins(A-K)，但對細胞周期有明確調控作用的細胞周期蛋白是cyclinA、B、C、D1～3和E，其中A、B的峰值和主導作用主要出現在M期，故又稱為M期cyclins，C、D、E的峰值和主導作用主要出現在G1期，故又稱為G1期cyclins［4］。目前研究的多集中于cyclinD、E，特別是cyclinD1。作為細胞周期主要的正態調控因子之一的cyclinD1的作用是調節細胞周期G1期啟動進入S期，因此在細胞周期早期調控中，一旦cyclinD1過量表達就會引起細胞生長增殖過快［5］。

細胞周期蛋白依賴性激酶是一種蛋白激酶家族，它們通過磷酸化-脫磷酸化的方式在細胞周期調控中發揮重要作用，促進細胞的增殖［2］。CDK可以與cyclin結合成CDK-cyclin復合物，共同促進細胞周期的運轉，其中CDK是催化亞基，cyclin是調節亞基［3］。

CKI通過抑制CDK活性從而在細胞周期進程中發揮作用。CKI可分為兩類:一類為激酶抑制蛋白(KIP)，包括3種結構相關蛋白(p21、p27和p57)，能抑制大多數CDK-Cyclin的磷酸化激酶活性;另一類為細胞周期蛋白依賴性激酶4抑制劑(INK4)，即p16家族，由4種相似蛋白(p15、p16、p18和p19)構成，特異性抑制 CDK4-cyclinD1、CDK6-cyclinD1的磷酸化激酶活性［3，5］。有研究表明，CIP/KIP對cyclinD/CDK4、cyclinD/CDK6起正性調節作用，p16蛋白對cyclinD/CDK4起負性調節作用［3］。

2 IRI與細胞周期調控的關系

細胞的發生和發育有賴于細胞周期的正常有序運行。由于兩個主要檢驗點的控制，細胞周期事件遵守嚴格的時相順序。IRI后，細胞周期檢驗點將受損傷的細胞阻滯在相應的位置進行修復，若修復成功，細胞進入下一個周期，否則發生凋亡。細胞凋亡是細胞的程序性死亡過程，受多種基因和蛋白的調控［6］。

2.1 腎IRI時細胞周期調控 腎臟作為高灌注器官，非常容易發生IRI，而腎IRI是自體腎發生急性腎衰竭的主要原因［7］。在腎IRI時，p21的表達是引起G1期阻滯的直接原因，而p53在其中也發揮了重要作用，它可通過下游基因p21的高表達對細胞周期進行調控，從而保護腎臟。Andreucci等［8］研究提示，Ⅰ型的磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide-3 kinase，PI3K)和其下游分子絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(protein kinase B，PKB)所組成的信號通路(即PI3K/Akt信號通路)在腎IRI中起重要的調控作用。

2.2 腦IRI時細胞周期調控 細胞正常的生命活動需要細胞周期的調控，而越來越多的證據也表明缺血性腦損傷后存在細胞周期的異常激活［9］。CDK5是神經系統中重要的激酶之一，是腦缺血再灌注時神經細胞凋亡過程中重要的上游因子，在腦缺血損傷機制中起重要作用［10］。宋鐵山等［11］研究顯示，腦IRI后，cyclinD1、CDK4異常表達可能是引起神經元凋亡的主要因素，其中cyclinD1的異常增高與神經元凋亡的關系更為密切。另有實驗證實，剔除cyclinD1基因能夠明顯抑制星形膠質細胞的增殖［12］。

2.3 肝IRI時細胞周期調控 肝移植是目前治療肝衰竭最有效的方法之一，但肝熱IRI常引起移植后肝功能不良，甚至導致移植肝原發性無功能，因而有必要深入探討肝熱IRI的機制，改善術后早期肝功能的恢復［13］。肝熱IRI的發生、發展受多途徑、多基因的網絡調控，臨床上采用單獨抗感染治療的效果并不令人滿意［14-15］。研究顯示，組織缺血/再灌注時核因子κB活性增高，參與調控細胞周期進程，可誘發和加重組織的損傷［16］;相反，阻斷核因子κB的活性，組織器官的再灌注損傷可明顯減輕［17-18］。細胞凋亡是肝臟IRI的特征之一［19］。有實驗提示，鼠肝缺血30 min后再灌注期細胞DNA損傷的修復和細胞凋亡程序的活化過程有可能是通過p53基因介導的［20］。張劭等［21］進一步研究表明，當細胞受到肝熱IRI時，p53-Gadd45-PCNA途徑表達上調，使有DNA損傷的細胞停滯于G1期進行DNA修復或促使無法修復的肝細胞凋亡，其中Gadd45a mRNA、Gadd45g mRNA的表達分別較再灌注前上升8.3倍和7.0倍。

2.4 視網膜、心臟IRI時細胞周期調控 視網膜IRI是眼科常見的病理過程，主要通過凋亡的形式導致視網膜神經元的死亡。有實驗證實，在視網膜IRI中cyclinD1與細胞凋亡密切相關［22］。

研究發現PI3K/Akt通路在心臟IRI后的修復過程中起重要的調控作用［23］。Hausenloy等［24］研究發現，可以通過缺血預處理增強PI3K/Akt信號途徑，從而對心臟IRI起保護作用。

3 研究IRI時細胞周期調控的意義

手術、創傷后應激反應一方面有利于機體抵御外來損傷，另一方面如反應過于激烈或調節失衡，也會造成自身的損傷，因此研究創傷后，應激反應中的細胞周期調控就可以在臨床上有效地控制炎性反應，促進細胞修復，阻止細胞凋亡，從而減少應激性疾病的發生，減少應激給機體帶來的危害。

在細胞周期調控中cyclinD1是正態調控因子，因此可通過上調cyclinD1的表達而促進細胞的增殖，修復損傷的組織;相反，剔除cyclinD1基因可以明顯抑制星形膠質細胞的增殖。在臟器經受IRI之前給予一短暫的血流阻斷又復灌，從而減輕臟器的IRI，稱為缺血預處理［25］。蔡方剛等［26］的研究表明，經過缺血預處理，肝細胞在復灌早期cyclinD1的表達明顯上升，推動著G1期向S期發展，從而促進細胞的增殖。治療腦缺血時應注意調控星形膠質細胞和神經元細胞各自的凋亡機制［27］。Trimsit等［25］認為，腦缺血后要判斷缺血的神經元是否進入病態的細胞周期，可以以cyclinD1表達的水平作為指標。宋鐵山等［11］進一步研究顯示，兼具鎮靜麻醉作用的藥物異丙酚可以降低腦缺血/再灌注后cyclinD1表達的水平，從而降低神經元凋亡率，減輕缺血/再灌注對大鼠海馬神經元的損傷。異丙酚也可以減輕大鼠肝臟、腎臟IRI［28］。另有研究表明，對視網膜缺血/再灌注組注射堿性成纖維細胞生長因子后，cyclinD1的表達顯著降低，進而抑制細胞凋亡，在視網膜IRI中起到保護作用［22］。

CDK4可以與cyclinD1結合成cyclinD1-CDK4復合物，共同促進細胞由G1期向S期過渡。近年來有多項研究表明，在腦IRI時，聯合針刺水溝、內關、曲池、足三里穴能夠使CDK4的表達減少，從而抑制神經元的凋亡［29］。另外，曲忠森等［30］指出，急性腦IRI時，細胞內游離Ca2+濃度升高可能增加CDK5的活性，從而加劇腦IRI。因此，可以利用鈣通道阻滯劑尼膜地平降低海馬神經元內的Ca2+濃度，進而降低CDK5的活性，從而減輕腦IRI。

綜上所述，細胞周期的調控與IRI關系密切。但是，IRI中的細胞周期調控是個極為復雜的過程，目前的認識還不夠深刻，尤其是在肝IRI方面，國內外的報道還不多，有待進一步深入研究。

［1］ Iniquez M，Dotor J，Feijoo E，et al.Novel pharmacologic strategies to protect the liver from ischemia-reperfusion injury［J］.Rec Pat Card Drug Discov，2008，3(1):9-18.

［2］ 趙新，楊玉珍.細胞周期蛋白H在細胞周期調節中的作用［J］.胃腸病學和肝病學雜志，2007，16(6):615-617.

［3］ 李峰，陳臨溪.細胞周期蛋白D與細胞周期調控研究進展［J］.國外醫學生理、病理科學與臨床分冊，2005，25(3):270-273.

［4］ 林松挺，楊玉珍.細胞周期蛋白G參與細胞周期調控的機制［J］.胃腸病學和肝病學雜志，2006，15(3):320-322.

［5］ 梁大寧，高建華，魯峰.小干擾RNA抑制CyclinD1表達誘導瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡的研究［J］.中華整形外科雜志，2008，24(4):307-310.

［6］ Toronyi E.Role of apoptosis in the kidney after reperfusion［J］.Orv Hetil，2008，149(7):305-315.

［7］ Furuichi K，Wada T，Kaneko S，et al.Roles of chemokines in renal ischemia/reperfusion injury［J］.Front Biosci，2008，13:4021-4028.

［8］ Andreucci M，Michael A，Kramers C，et al.Renal ischemia/reperfusion and ATP depletion/repletion in LLC-PK(1)cells result in phosphorylation of FKHR and FKHRL1［J］.Kidney Int，2003，64 (4):1189-1198.

［9］ Love S.Neuronal expression of cell cycle-related proteins after brain ischaemia in man［J］.Neurosci Lett，2003，353(1):29-32.

［10］ Timsit S，Menn B.Cerebral ischemia，cell cycle elements and CDK5［J］.Biotechnol J，2007，2(8):958-966.

［11］ 宋鐵山，王欣，李旭光.異丙酚對大鼠腦缺血再灌注海馬細胞周期因子變化及神經元凋亡的影響［J］.中國病理生理雜志，2009，25(4):810-812.

［12］ Zhu Z，Zhang Q，Yu Z，et al.Inhibiting cell cycle progression reduces reactive astrogliosis initiated by scratch injury in vitro and by cerebral ischemia in vivo［J］.Gila，2007，55(5):546-558.

［13］ 肖建生，葉啟發.肝缺血再灌注對細胞周期的影響［J］.中國現代醫學雜志，2002，12(8):17-19.

［14］ Jaeschke H.Mechanisms of liver injuryⅡ mechanisms of neutrophil-induced liver cell injury during hepatic ischemia-reperfusion and other acute inflammatory conditions［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2006，290(6):G1083-G1088.

［15］ Lee CH，Kim SH，Lee SM.Effect of pyrrolidine dithiocarbamate on hepatic vascular stress gene expression during ischemia and reperfusion［J］.Eur J Pharmacol，2008，595(1/3):100-107.

［16］ Gu XP，Jiang Y，Xu FT，et al.Effect of cold-ischemia time on nuclear factor-kappaB activation and inflammatory response in graft after orthotopic liver transplantation in rats［J］.World J Gastroenterol，2004，10(7):1000-1004.

［17］ Tsuchihashi S，Tamaki T，Tanaka M，et al.Pyrrolidine dithiocarbamate provides protection against hypothermic preservation and transplantation injury in the rat liver:the role of heme oxygenase-1［J］.Surgery，2003，133(5):556-567.

［18］ Suetsugu H，limuro Y，Uehara T，et al.Nuclear factor kappaB inactivation in the rat liver ameliorates short term total warm ischaemiareprefusion injury［J］.Gut，2005，54(6):835-842.

［19］ Cursio R，Miele C，Filippa N，et al.Liver HIF-1 alpha induction precedes apoptosis following normothermic ischemia-reperfusion in rats［J］.Transplant Proc，2008，40(6):2042-2045.

［20］ 盧綺萍，吳在德，李德忠，等.肝缺血再灌注細胞凋亡現象及Fas蛋白、PCNA、p53、bcl-2mRNA表達［J］.中華肝膽外科雜志，2001，7(4):224-227.

［21］ 張劭，何曉順，馬毅，等.肝臟熱缺血再灌注損傷對細胞周期調控相關基因表達的影響［J］.中華外科雜志，2007，45(5):335-338.

［22］ 袁春燕，周占宇，牛膺筠，等.視網膜缺血再灌注損傷中WTp53蛋白、CyclinD1表達的研究及bFGF對其的影響［J］.眼科研究，2005，23(2):151-154.

［23］ Matsui T，Tao J，del Monte F，et al.Akt activation preserves cardiac function and prevents injury after transient cardiac ischemia in vivo［J］.Circulation，2001，104(3):330-335.

［24］ Hausenloy DJ，Tsang A，Mocanu MM，et al.Ischemic preconditioning protects by activating prosurvival kinases at reperfusion［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，288(2):H971-H976.

［25］ Trisit S，Rivera S，0uaghi P，et al.Increased cyclin D1 in vulnerable neurons in the hippocampus after ischemia and epilepsy:a modulator of in vivo programmed cell death［J］.Eur J Neurosci，1999，11(1):263-278.

［26］ 蔡方剛.葉啟發.Cyclin D1在大鼠肝缺血預處理和缺血再灌注損傷中早期復灌的表達［J］.中華實驗外科雜志，2006，23(9): 1067-1068.

［27］ 王萍，高學文，李潤今，等.星形膠質細胞和神經元凋亡的細胞周期時相分布特征［J］.中華神經醫學雜志，2008，7(4): 329-332.

［28］ 張琰，冷玉芳，方七五.異丙酚后處理聯合缺血后處理對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的影響［J］.中華麻醉學雜志，2010，30 (1):86-89.

［29］ 甘云波，黃光英，張明敏.針刺對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后神經元凋亡的影響［J］.中華物理醫學與康復雜志，2008，30(1):28-30.

［30］ 曲忠森，畢建波，李亮.全腦缺血再灌注損傷大鼠海馬細胞周期依賴性蛋白激酶-5的變化［J］.中國神經免疫學和神經病學雜志，2009，16(1):51-53.